循环肿瘤细胞在胰腺癌诊治中的研究进展

王鑫，黄静，刘烨磊，陆才德

作者单位： 315000 宁波，宁波大学医学院（王鑫、刘烨磊）；宁波市医疗中心李惠利医院（黄静、陆才德）

胰腺恶性肿瘤主要为胰腺导管腺癌（PDAC），而大多数PDAC 确诊时已经为晚期。PDAC 的侵袭性极强，且对靶向治疗和细胞毒性治疗的反应较差。现阶段PDAC缺乏典型的早期临床症状及较敏感的生物标记物，且早期胰腺肿瘤的穿刺活检较困难，早期难以发现[1]。尽管近期超声内镜下活检已取得一定的进展，有利于PDAC的诊断，但穿刺活检假阴性率较高[2]。循环肿瘤细胞（CTCs）被认为是多类实体肿瘤另外一种转移方式，包括肝癌、胰腺癌等，即使在外科手术切除后外周血中仍能检测到CTCs，利用CTCs 检测早期胰腺肿瘤，具有安全性高、耐受低及敏感性高等优点，可用于胰腺疾病的早期检测、预后、治疗方案选择和疾病预后监测等方面。本文就CTCs在胰腺癌诊治中的进展作一综述。

1 CTCs 概述

CTCs 最早在19 世纪的时候提出，肿瘤细胞可以被动从实体肿瘤上脱落[3]，或者通过上皮间充质转变（EMT）而发生主动转移。在外周血中只有极少量的CTCs，这对于检测和分离CTCs造成了极大的困难，随着肿瘤转移机制研究的深入和检测技术的进步，目前研究人员能够使用液体组织活检技术从一个简单的血液样本中寻找到CTCs。由于CTCs 源自于原发实体肿瘤[4]，因此CTCs 可以提供一个非侵入性的方法来诊断和评估胰腺癌的类型以及肿瘤现处于的阶段，而对CTCs的重复收集和分析也可以用于检测疾病的进展以及患者对治疗的实时反映。

2 CTCs 的分离

从血液成分中分离CTCs的技术，大多数可以被归类为基于其生物属性或其物理属性（包括其细胞大小、密度），一旦CTCs被分离，它们能够通过免疫细胞化学、免疫荧光、显微镜分析生物标记等方式被确定，现阶段主要分离的方法有细胞过滤技术（ISET）、密度梯度离心法（DGC）、荧光激活细胞分选（FACS）、免疫磁珠分选法（MACS）等方式[5]。

2.1 物理方式 CTCs较正常细胞相比具有更低的浮力密度及更大的体积[6]。基于密度的分离方法常常基于Onco Quick 试剂盒，通常情况下血液样本会被稀释，并在介质上分层，最后使用离心机进行分离。除了密度梯度分离之外，OncoQuick合并了多孔膜，能减少与CTCs相似密度的血细胞的数量[7]。而ISET 则使用聚碳酸酯薄膜过滤器，用8 m 大小的圆柱孔来获取血液样本中的CTCs[8]。目前也有部分研究人员使用双向电泳分离肿瘤细胞，利用肿瘤细胞的介电性能来分离出可行的CTCs，这种特性在不同细胞中类型不同，可用来分离肿瘤细胞以用于培养和分析。

2.2 生物性质分离 大多数以免疫为基础的CTCs 浓缩方法，都利用上皮细胞表面生物标志物的表达来识别CTCs，其中最常使用的是上皮细胞粘附分子（EpCAM）。在分离过程中，磁性微珠表面会被涂上EpCAM 抗体，之后通过一个特定磁场来吸引已经结合CTCs 的磁性微珠，从而可以达到分离CTCs 的目的。MACS 可分为正性分离和负性分离，正性分离指从样品血液中分离得到肿瘤细胞，负性分离指从血液样本中去除其他无关血细胞而得到肿瘤细胞。现阶段微流体设备也用于CTCs 富集，其表面带有EpCAM 抗体涂层用于结合CTCs，具有微型化、成本低及特异性高等特点。现今将CTCs 吸引到导丝的概念已经应用于体内，Saucedo-Zeni等[9]设计了一种EpCAM 功能化的医用Seldinger 导丝，将其插入患者的静脉血管中，以捕捉和富集CTCs，这设备将来可能用于直接从PDAC 患者体内检测CTCs。CellSearch 系统是唯一一种美国食品和药物监督管理局批准的CTCs 检测系统，该系统采用以EpCAM为基础的免疫磁珠富集法从而用于检测CTCs，之后根据CD45 阴性，CK8、CK18 和CK19为阳性来分离获得CTCs[10]。然而CTCs检测目前仍未发现特异性靶点，各种方法检出率也不尽相同，如上述EpCAM靶点，仅为上皮细胞标志，而非胰腺癌肿瘤细胞特异性靶点。

3 CTCs 在胰腺癌治疗中的应用前景

3.1 检测和诊断 CTCs可用于胰腺癌的早期检测及诊断，He 等[11]分别检测了CTCs、循环肿瘤DNA（CT-DNA）以及组织活检中EGFR 突变的情况，得到了高达95%的一致率。当前影像学作为肿瘤的常规检测手段，临床医生很难发现较小的实体肿瘤，通过国内外研究可以看到，很多肿瘤在2 ～4 mm 的情况下已经有肿瘤细胞进入血液循环，甚至在远处形成新的病灶。其他癌前病变（如IPMN）或良性病变（如慢性胰腺炎）必须通过影像学和超声内镜下活检与癌症相鉴别。在Rhim 等[12]的一项研究中，33%的IPMN 患者中发现循环内皮细胞（CECs），但未发现CTCs，而在PDAC患者中，73%的病例中CTCs 呈现阳性。因此CTCs 能够为胰腺肿瘤的定性提供一定的参考价值，从而避免穿刺活检给患者带来的伤害。

研究报告了从门静脉与外周血分离的CTCs 的潜在差异。在一项对20 例胰腺癌患者的研究中，Bissolati 等[13]发现，在随访3 年的患者中，从门静脉中可检出的CTCs 的患者较CTCs 阴性患者具有更高的转移率。在另一项类似的研究中，Catenacci 等[14]对18 例PDAC 患者进行研究，在超声内镜下获取受试患者门静脉血液样本，CTCs 阳性率为100%，而在外周血循环中只有4 例患者发现CTCs，提示门静脉血相较于外周血CTCs 检测率明显升高。国内研究人员通过超声内镜下穿刺PDAC患者门静脉获取血液标本，提示CTCs 检出率为100%[15]。在超声内镜进一步推广后，通过门静脉检测CTCs 技术的安全性及实用性将大为提高。

3.2 预后和监控 在对胰腺癌CTCs 研究的广泛文献检索中发现，CTCs阳性患者普遍具有较差的无瘤生存期及总存活率。Han 等[16]评估了共623 例PDAC 患者，在268 例患者的血液样本中检测到CTCs（43%）；这些患者的无进展生存期和整体存活率较CTCs检测阴性的患者要短得多。

晚期PDAC患者的化疗后评估常常通过影像学完成，然而研究发现通过化疗后CTCs检测可评估化疗效果，从而指导临床化疗选择。在实验研究中，Bidard等[17]评估了29 例晚期PDAC 患者的CTCs阳性率和存活率之间的相关性，这些患者行化疗治疗2 个月后行CTCs 检测，提示CTCs阳性的患者多为低分化肿瘤，且总体存活时间较短。Okubo 等[18]评估了65 例胰腺癌患者，在21 例患者中血液样本中找到CTCs，并且全部CTCs阳性患者皆为晚期胰腺癌，此项研究也表明当进行化疗3 个月后，CTCs检测仍为阳性的患者总生存率低于CTCs 转阴患者。另一些研究对CTCs 的评估与患者的肿瘤发展联系提供了更细致的见解。Gemenetzis 等[19]通过实验指出，当影像学能够提示肿瘤复发前的2 个月，研究人员就能发现患者体内CTCs 出现明显的增高；一项荟萃分析纳入19项研究，1 320 例确诊个体，经过Meta 分析显示CTCs 阳性患者的总生存期（P ＜0.001）和无进展生存期明显缩短（P=0.003），此外，按种族划分的亚组分析表明，CTCs阳性患者在亚洲和西方人群中的总生存期都明显缩短，并无人群差异[20]。

外周血中癌细胞不是均一的种群，而是由不同种类的细胞构成，某些亚种群在肿瘤进展和转移中起着主要作用。且现有文章表明发生EMT的CTCs处于“冬眠”，大部分无法增值形成转移灶，遂需要寻求新的特异性标志物以鉴别最终形成转移灶的CTCs[21]。Sun 等[22]对46 例行手术切除的PDAC 患者进行研究，将捕获的CTCs 分化为上皮型（E-CTCs）、间叶型（M-CTCs）和杂交型（H-CTCs）三种表型，结果提示H-CTCs在PDAC转移中具有良好的预测作用，而E-CTCs 在PDAC 患者OS 方面起到良好的预测作用，E-CTCs＜11.0CTCS/2ml患者中位OS为16.5 个月，E-CTCs＞11.0CTCS/2ml 患者中位OS 为5.5 个月（P=0.016）。对CTCs进行分型能够使CTCs在胰腺癌预后方面起到更好的预测作用。

3.3 单细胞测序 在检测到实体肿瘤之前，已经可从患者身上分离出CTCs，且肿瘤的发生与发展和细胞基因的突变密切相关[23]。因此，对CTCs 中致癌基因和抑癌基因的突变分析，以及对单细胞畸变染色，可以用来证实CTCs 的肿瘤来源从而达到诊断目的[24-25]。从胰腺癌的基因组分析中可以了解到，根据不同的分子亚型可对PDAC 进行分类，从而能够揭示出潜在的治疗靶点[26]。WNT基因在PDAC细胞中的表达抑制了肿瘤凋亡，并增加肿瘤转移倾向，Yu 等[27]对11 例PDCA 大鼠进行CTCs 中RNA 测序，有5 例CTCs 显示WNT 信号富集，因此对于CTCs 的单细胞测序能够提供肿瘤潜在的治疗靶点。基因测序的改进使研究人员能够对CTCs 样本进行基因组分析，明确与患者预后和治疗反应相关的基因改变，从而帮助指导患者治疗方案的制定。Ting 等[28]比较了从胰腺癌小鼠身上分离出的CTCs 和相应的原发性肿瘤的全基因组表达谱，其中单细胞DNA 测序显示，与原发肿瘤细胞相比，CTCs 表达了大量基质衍生的细胞外基质蛋白，发现它们增加了肿瘤细胞的侵入性和迁移性，从而促进肿瘤的转移。现阶段全基因测序存在潜在的非法转录和放大偏误，这将成为单细胞分析的一个巨大挑战。

3.4 体外预测模拟 随着更多的细胞毒性和生物治疗药物的出现，为了远离传统经验疗法，现阶段需要开发能够预测患者对药物反应的试验。CTCs 可以在体外培养，可以通过CTCs 对不同药物的敏感性，从而选择最佳的治疗方案，实现个性化治疗。且利用CTCs 比原发性实体肿瘤细胞更加有利，CTCs存在着负责转移的起始和将肿瘤传播其他部位的能力，而干预转移是提高疗效的关键。现今体外CTCs 培养虽仍处在挑战，大多数方案在样本前处理、富级分选过程和培养条件不当都会导致对CTCs 不可逆的损伤，且由于长期培养和多次传代可能致使CTCs 在基因表达和表观遗传学方面不再代表原始肿瘤的表型。CTCs细胞株培养的效率现有所提高，提高效率的方法包括使用非附着的三维培养条件、基质支撑层或低氧条件来增加CTCs 的生存。尽管存在挑战，但这一领域的进展可以改善患者的诊断和管理。现阶段CTCs 能够被长期体外培养，且肺癌或乳腺癌患者的CTCs 已经被成功地在体外培养用于检测治疗药物疗效[29-30]，但对于胰腺癌患者CTCs 仍缺少足够的实验来支持它的临床应用。

4 结论

胰腺癌在目前来说是一种高度侵袭性的疾病，在过去的许多年里，患者的预后改善不明显。持续发展更为敏感、高通量和高效的CTCs 检测方式，能够加强CTCs 在临床中的应用。对CTCs 的深入研究可以增加对胰腺癌的形成、进展、转移和肿瘤内异质性的更深一步的认识，并能够使个性化医疗的体外药物测试平台得到进一步的发展。对于高风险的疑似患者，可能在未来常规体检时能够接受CTCs 的筛选，从而增加对胰腺癌的早期检测。虽然胰腺癌中找寻CTCs的研究为胰腺癌转移、诊断和治疗提供新的思路，但在当前情况下仍有大量未探索的问题等待深入研究，比如如何高效的收集CTCs，进一步的找寻CTCs 的细胞生物学特性和特异分子标志物等。