冰冻组织样本病理质控在转化研究中的应用价值

王灿铭，张慧萍，黄旻然，吴映雪，泮晓丹，胡锦林，应莉莎，苏丹

在精准医学时代，随着转化医学研究的快速发展，组织样本的需求日益增长。虽然甲醛固定的石蜡包埋组织能解决部分研究的需求，但在大多数情况下，冷冻组织更受研究者的青睐，尤其是保存完好及高质量的样本，可确保下游实验的顺利进行和结果的准确性。通常，研究者对冰冻样本的核酸质量和浓度比较关注，是下游分子生物实验前的常规检测[1]，但冰冻样本病理质控常被忽略，如病理诊断的再复核及肿瘤细胞含量等。有研究表明，10%的冷冻组织样本不适合下游分子检测，主要原因包括取材或诊断的不准确可导致研究结果偏倚[2]。冰冻组织样本病理质控在转化研究中扮演着至关重要的作用。本研究对93 例非小细胞肺癌共848 份组织样本进行冰冻染色、病理诊断复核和肿瘤细胞含量评估。此外，对部分组织DNA 及RNA浓度与质量进行分析，为下游RNA测序和基因组测序的顺利进行和结果分析及解读奠定基础。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 组织样本 选取中国科学院大学附属肿瘤医院生物样本库2008 年4 月至2015 年7 月在－80 ℃低温冰箱保存的非小细胞肺癌样本93 例，其中鳞癌65例，腺癌28 例；手术时年龄44 ～77 岁，平均（63.4±7.3）岁；均为男性。根据生物样本库的样本库存情况，每个病例取肿瘤组织、癌旁组织（离肿瘤组织1 ～1.5 cm处）和远离肿瘤的正常组织（离肿瘤组织5 cm以外或更远处）各1 ～4 份，共计组织样本848 份。其中肿瘤组织315 份，癌旁组织204 份，正常组织329 份。所有样本均为中国科学院大学附属肿瘤医院手术样本，标本离体后30 min 内由生物样本库专职人员取材，分装在有RNA 保存液的冷冻管后放入液氮中临时保存，后转入－80 ℃低温冰箱中保存。

1.2 实验设备及材料 三洋冰箱、赛默飞NX50 冷冻切片机、OCT包埋剂、Nano Drop 2000 分光光度计、Agilent2100 生物分析仪及核酸提取试剂盒等。

1.3 组织样本病理形态学评估

1.3.1 冷冻切片的制作 组织样本通过冷冻切片机制作冷冻切片，制片前机器设备去除RNA对样本的影响，包括冷冻切片机的消毒清洗；制片前先将冷冻切片机断电化霜清洗，清洗干净后箱体内擦焦炭酸二乙酯（DEPC）水，一次性切片刀在DEPC 水中浸泡10 min；冷冻切片机箱体温度预先设置－30 ℃。制片时打开速冻台制冷，切片用力均匀，防卷板调整至合适位置；每切一个样本换一把新刀，同时将切片刀座、防卷板等部件用无水酒精擦拭，避免污染；待切样本在干冰中临时保存，切片时直接从干冰中拿取；在冷样本托上用适量OCT 包埋剂将组织包埋好，压上冷冻锤放置于速冻台至组织完全冷冻；癌组织切片厚度为5 m，正常组织可适当加厚至6 m；匀速切片后经甲醇固定，进行HE 染色，封固；冰剩组织去除OCT包埋剂后放入RNA保存液中低温保存，用于下游实验。

1.3.2 镜下形态学观察 冷冻切片制作完成后由高年资病理医师镜下阅片，诊断切片与原病理结果是否一致，并计算肿瘤组织样本中肿瘤细胞所占的比例。

1.4 RNA 的提取及质控

1.4.1 组织样本总RNA提取方法（1）组织置于离心管后在液氮下研磨成粉，取少量加至有1 ml Trizol 的1.5 ml 离心管中，充分混合后于4 ℃，12 000 r/min离心15 min。（2）取上清移至新1.5 ml离心管中，加入200 l氯仿，剧烈震荡直至呈乳白色，于4 ℃，12 000 r/min 离心15 min。（3）取上清移至新1.5 ml 离心管中，加入500 l 异丙醇，轻轻颠倒10 次，冰上放置20 min，于4 ℃，12 000 r/min 离心15 min。（4）弃上清，加入1 ml 75%乙醇（用DEPC水现配现用），于4℃，12000r/min离心5 min，重复此步骤一次。（5）弃上清后，室温干燥5 ～7 min。（6）加入20～30 l 的DEPC 水溶解沉淀65 ℃溶解，－20 ℃保存。

1.4.2 RNA 纯度和完整性检测 取2 l提取好的RNA溶液，利用分光光度计检测其浓度和纯度，通过OD260/280 判断RNA 纯度。利用Agilent2100 生物分析仪测量RNA 的完整性指数（RIN）。

1.5 DNA 的提取及质控

1.5.1 DNA提取方法（1）冷冻样本加入10 倍体积的组织保护液，置于4 ℃中解冻。（2）往20 ～60 mg 组织样本中加入1 ml 0.9%氯化钠注射液，振荡混匀，12 000 r/min 离心2 min，小心去除上清，加入180 l Buffer DTL，将组织处理为匀浆。（3）加入20 l Proteinase K Solution，振荡混匀，56 ℃消化至获得较清透的组织溶解液。（4）取出样品管，用掌式离心机离心5 ～10 s。（5）加入200 l BufferDTB和200 l无水乙醇，振荡混匀后离心5 ～10s。（6）将全部液体转移至DNA 吸附柱中，8 000 r/min 离心1 min，倒掉收集管中的液体。（7）往DNA 吸附柱中加入600 l Buffer DW1，8 000 r/min离心1 min，倒掉收集管中的液体。（8）往DNA 吸附柱中加入600 l Buffer DW2，8 000 r/min 离心1 min，丢弃收集管。（9）换用新的收集管，12 000 r/min离心3 min，丢弃收集管。（10）将吸附柱小心转移至干净的1.5 ml 离心管中，往DNA 吸附膜中心滴加30 ～100 l Buffer DTE（勿碰到DNA 吸附膜），室温静置1 ～5 min，12 000 r/min 离心1 min，收集样品DNA 并保存。

1.5.2 基因组DNA（gDNA） 分别使用QIAamp DNA MiniKit 和QIAamp DNA Blood Mini Kit（凯杰公司，Hilden，德国）从肿瘤和邻近肿瘤肺和白细胞层提取。使用Qubit 荧光仪和dsDNA 高灵敏度检测试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）测定DNA 浓度。使用Agilent2100生物分析仪（安捷伦科技，美国加州圣克拉拉）评估DNA 的分布。

2 结果

2.1 组织样本病理形态学评估 93 例非小细胞肺癌样本通过制作冷冻切片病理评估发现，有6 例与原诊断不符合，其中1 例诊断为肉芽肿性病变，1 例肠癌肺转移，3 例癌组织内无癌细胞，1 例癌旁组织中有癌细胞；在315 份肿瘤组织中，肿瘤部分所占比例≥30%的占77.8%（245/315）；在204 份癌旁组织中，发现1份阳性样本，1 份可疑阳性；在329 份正常组织中，发现8 份阳性样本。总样本的病理诊断合格率为93.55%（87/93），癌组织77.8%（245/315），癌旁组织99.02%（202/204），正常组织97.57%（321/329）。

2.2 RNA 的纯度和完整性评估 在选取的172 份RNA 样本中，RNA 纯度OD260/280 为2.037±0.57，RNA 纯度OD260/280≥1.8 占98.84%（170/172）；RNA 分子RIN 为7.47±1.69，RIN≥7 占82.56%（142/172）；RIN ＜4 占6.98%（12/172）。其中有1 份OD260/280 为9.4，RIN=1，RNA 已降解。

2.3 DNA 的浓度及质量 在选取的165 份DNA 样本中，DNA 最大浓度为200.69 ng/ l，最小浓度为11.60 ng/ l，平均131.29 ng/ l，中位值134.07 ng/ l，低于60 ng/ l 的样本5 份。条带降解度＞1 000 bp 有161 份，500 ～1 000 bp 有3份，小于500 bp 有1 份。

3 讨论

高质量及高标准的生物样本库是基础和临床研究的样本来源，也是实现转化医学和精准医学的物质基础[3]。样本质量是生物样本库的核心，对生物样本库的质量评估往往围绕DNA与RNA进行[4-5]。然而，大约10%的冷冻样本是不适合进行分子分析的，主要原因是样本的取材和保存[2]。因此，组织样本进行分子分析前进行病理评价是十分必要的。

本研究对生物样本库的组织样本质量在组织形态学的基础上进行评估，再进行核苷酸纯度和完整性的检测。通过冷冻切片对冷冻样本的病理形态学分析发现，癌组织与正常组织的病理诊断结果产生偏移，而RNA 和DNA 质量是良好的，这说明生物样本库中冷冻样本在RNA 和DNA 层面的结果是可行的。目前分子病理存在的主要问题是由于样本导致的错误率较高。在实验环节，分析前和分析后错误发生的频率更高，由于分析问题导致的错误随着时间的推移已经显著减少，大部分错误是分析前造成的，占总错误的46%～68.2%[6]。在生物样本库分析前因素中，不仅关注患者的内在因素、热缺血时间和冷缺血时间等[7]，更要在标准的操作规程（SOP）中进行严格的质量管理和质量控制，包括组织学的证实[8]。生物样本库实际保存的样本与病理报告中的组织存在一定的差异，这种差异足以影响研究的结果[9]。在病理评估中，确认该组织是否是肿瘤组织及肿瘤细胞含量等都是决定下游研究结果的前提[10]。

本研究中癌旁组织和正常组织中出现阳性样本，肿瘤组织样本中肿瘤细胞所占比例≥30%的占77.8%，造成这种差异的原因可能是样本库组织取材较小，同一样本肿瘤的分化程度不同，取材位置不同，肿瘤成分比例也不同，所取样本不足以概括肿瘤全貌。样本库冷冻小组织也增加了冷冻切片的难度，皱褶、切片不完整等都有可能造成阅片时肿瘤细胞计数的偏差。对照RNA 及DNA 的结果表现，肿瘤细胞占比≥30%可以说明样本的病理准确性。对研究用的样本组织进行冷冻切片时，更要避免样本污染，用熟练的冷冻切片技术和严谨的工作态度提高切片的质量，通过对冷冻样本的病理质控，可进一步提高下游实验结果的准确性。