环状RNA及其在胰腺癌中的研究进展

何日升，徐艺，崔云甫

哈尔滨医科大学附属第二医院胆胰外科，黑龙江 哈尔滨 150086

胰腺癌预后差，这与胰腺癌发病较其他肿瘤更为隐匿、病程早期即有组织侵犯和远处转移、手术方式的选择有限以及该病对辅助治疗反应较差有关，这几项因素导致病人的5年生存率极低，经临床数据统计后发现只有8%，如果胰腺癌发生远处转移，这个比率则进一步下降，只有3%[1-2]。尽管我们可以通过CA19-9水平、影像学资料如CT以及MRI等获得初步诊断依据，但对这些检查的准确性仍不十分满意，尤其是在病程早期阶段，很多检查可能为阴性结果[3]。此外，肿瘤细胞内基因和蛋白质表达水平改变以及肿瘤微环境中细胞间相互作用为侵袭转移和耐药创造了条件，但其具体机制仍需进一步研究[4]。目前胰腺癌诊治面临的主要障碍是缺乏早期特异性诊断的生物标志物和治疗靶点，迄今为止，尽管已经有很多人在胰腺癌方面进行了大量的相关研究，但其发病率和死亡率每年仍有上升的趋势，而且胰腺癌在年轻病人中的发病率每年也有上升的趋势。手术切除肿瘤和转移性病变是目前唯一可治愈该疾病的方法，术后病人常接受辅助化疗，如吉西他滨，然而仅有30%的病人对西吉他滨治疗方案有效，更糟糕的是许多胰腺癌病人从患病、病情发展到晚期都没有明显的症状，导致错过了诊疗的最佳时间[2,5]。这些错过最佳治疗时间的病人往往只能行保守治疗如化疗或者手术方式下行改道从而解除肿瘤压迫产生的相关症状，而且到达这个阶段的病人其日常生活水平和生存时间往往都不尽如人意。所以寻找一种简便有效的确诊方法和治疗策略迫在眉睫。最近许多环状RNA(circRNA)被发现参与多种恶性肿瘤的发生、发展，包括胰腺癌，并有望成为潜在的诊断标志物和治疗靶点，这为胰腺癌病人带来了希望，将有助于解决胰腺癌早期诊断困难和治疗方式局限这两个困扰我们多年的问题。本文对circRNA及其在胰腺癌中的研究进展作一综述。

一、circRNA

circRNA是一种于20世纪70年代首先在病毒中观察到的共价封闭环状非编码RNA，这是一类特殊的RNA，circRNA功能与其他非编码RNA(如miRNA、lncRNA、snRNA、piRNA和siRNA)类似，虽然目前的研究发现通常情况下circRNA不能被翻译成蛋白质，但是它可以调控基因的转录和转录后的修饰[6]。与线性RNA有差别的是，circRNA是由pre-mRNA转录物反向剪接而成，其5′端和3′端相互连接形成一个封闭的环，它没有5′帽结构和3′多聚A尾，这使得circRNA不易被核糖核酸酶降解，因此circRNA可以维持稳定的细胞内表达。由于其独特的结构，circRNA在哺乳动物中非常稳定，在进化上高度保守，在表达方面具有一定的组织特异性和时间特异性。最近这几年随着RNA纯化技术、生物信息学分析、高通量RNA测序技术以及对各种circRNA研究工具的发展，目前测得的circRNA已经超过3万个，发现其在真核生物体内广泛分布[7]。以下就circRNA的功能作一简要的介绍。

1.circRNA的微小RNA(miRNA)海绵功能 circRNA主要通过经典的circRNA-miRNA-信使RNA(mRNA)轴影响并调控肿瘤生长、转移、增殖和化疗耐药性的基因表达水平。在生物体内circRNA主要是充当miRNA的海绵来发挥其作用，miRNA与mRNA的3′-UTR结合后会使得与这个mRNA有关的基因表达受限制，然而circRNA通常包含一个或多个miRNA响应元件，miRNA响应元件则可以与相应的miRNA结合，使miRNA失去功能，从而导致miRNA下游基因的表达恢复[8]。考虑到miRNA靶向基因的不同功能，有些miRNA的靶向基因的表达对肿瘤有促进作用，而另一些miRNA的靶向基因的表达对肿瘤则具有抑制作用。因此在肿瘤进展过程中，circRNA根据其特殊功能可分为促进肿瘤和抑制肿瘤两种类型。ciRS-7是一种典型的miRNA海绵，它包含70多个miR-7结合位点，可通过argonaute(AGO)蛋白与miR-7的结合发挥作用[6]。然而由于circRNA的表达程度较低和长度较短，一些circRNA不能作为miRNA海绵，这表明miRNA海绵活性可能并不是所有circRNA都具有。虽然只有部分circRNA具有miRNA海绵活性，但是由于circRNA数量庞大，随着研究深入，在不同疾病中仍然不缺乏具有海绵活性的circRNA，对这些circRNA的进一步研究可能为疾病的确诊和治疗提供方法。

2.circRNA的蛋白质海绵功能 除了对miRNA的海绵作用外，circRNA还可以充当蛋白质的海绵来调节细胞行为。有研究发现circ-Amotl1可以与心肌细胞中的丙酮酸脱氢酶激酶1和蛋白激酶B1(protein kinase B1，AKT1)相结合，导致AKT1磷酸化并将其转运到细胞核中保护心肌免受损伤[9]。此外也有报道circ-Amotl1可以与信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)相结合并将它运送到细胞核中，这导致细胞的增殖加速并具有侵袭倾向，也导致肿瘤的发生概率增大[10]。因此我们可以得出circ-Amotl1有作为靶向治疗靶点的潜质。一些circRNA也可以用作“支架”以结合两种不同的蛋白质，介导它们之间的相互作用。例如，circFoxo3可以与细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin dependent kinase 2，CDK2)和细胞周期调节因子p21的复合物相结合形成一个三联体，从而加速CDK2和p21的解离，使细胞周期蛋白A(cyclinA)和细胞周期蛋白E(cyclinE)磷酸化，促进细胞周期的转变[11]。以上这些研究和发现均证实了circRNA在生物体内的蛋白质海绵功能，相信在这一领域的深入研究可以为某些疾病的靶向治疗提供了新的方法。

3.circRNA可翻译成蛋白质 由于circRNA没有5′端的帽结构以及3′端的多聚A尾，它是一个环形结构，因此与线性RNA不同，circRNA通常不能被翻译成蛋白质。然而，证据表明circRNA可能不是一种真正的非编码RNA，至少它们其中某些circRNA是可以被翻译的，体外研究表明，一些含有开放阅读框和内部核糖体进入位点元素的circRNA具有结合内源性核糖体并被翻译成蛋白质的能力[12]。circRNA可以被翻译成蛋白质的典型例子是在丁型肝炎病毒中，当丁型肝炎病毒感染宿主细胞后，其circRNA则被翻译成D-hepatic抗原[13]。有研究发现，circ-ZNF609包含从起始密码子开始的开放阅读框，和线性转录本相似，它以框内的终止密码子结束以形成一个循环，这种circRNA通过依赖剪切的方式而不需要依赖帽结构就可以翻译成特定的蛋白质，控制成肌细胞增殖[14]。此外，含有内部核糖体进入位点的circFBXW7和circSHPRH可以编码含F-框WD重复域蛋白7-185aa(FBXW7-185aa)和SNF2组蛋白连接分子PHD解旋酶-146aa(SHPRH-146aa)，敲除内部核糖体进入位点序列可导致胶质瘤细胞中这些circRNA失活，从而下调FBXW7-185aa和SHPRH-146aa[15-16]。然而，circRNA编码的蛋白是否可作为肿瘤治疗靶点或肿瘤生物学标志物目前仍然存在争议[16]。

4.circRNA的转录调制器功能 保留内含子的circRNA可与U1小核RNA、亲本基因启动子以及RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，RNA pol Ⅱ)之间产生某些作用，使其在细胞核中积累并通过促进转录作用从而提高亲本基因的表达。然而，内含子circRNA，例如circANKRD52和circsirt7，可以与RNA pol Ⅱ产生某些反应，从而阻碍亲本基因的表达[17]。有研究发现，编码基因可以通过典型剪接转录形成线性RNA，也可以通过非典型剪接转录形成环状RNA，由于对公共外显子的需求，这两种选择在表达上存在相互竞争，从而导致两者之间的动态平衡[18]。许多circRNA包含一个起始密码子，有时甚至是相关线性转录物的标准AUG，因此，circRNA的表达增加可使相关线性RNA的翻译失效，这种“选择性剪接”形式可以调控同源结构域相互作用蛋白激酶2/3等基因的表达[18]。

二、circRNA与胰腺癌

许多证据表明circRNA与自噬、凋亡、细胞周期和增殖关系密切，提示它们在各种疾病中可能发挥作用，如神经系统和心血管系统疾病，以及癌症等。因为circRNA的表达和临床病理参数之间有显著的相关性，以及其在体液包括血液、唾液、尿液和胃液等中的普遍表达，识别差异表达的circRNA对肿瘤的早期诊断和预后预测不仅安全、微创，而且较其他检查便宜。目前circRNA靶向治疗的基本策略是通过基因敲除、反义寡核苷酸和小干扰RNA(siRNA)抑制促进肿瘤的circRNA的表达，或者转染人工抑瘤circRNA等[19]。虽然我们已经对circRNA在肿瘤进展中的作用进行了大量的研究，例如circRNA在肺癌、胃癌、肝癌、胆管癌、卵巢癌和宫颈癌等疾病中的作用，我们课题组前段时间就发现在胆管癌中，circ-CCAC1可以加速肿瘤进展[20]，但是只有少数研究集中于circRNA在胰腺癌中的作用，尤其是在中国，这类研究最近几年才刚刚开始。

1.circRNA与胰腺癌的增殖 大量实验研究发现，胰腺癌中某些circRNA会出现表达程度的异常，这可能与肿瘤的增殖有关。hsa_circ_0006215/miR-378a-3p/SERPINA4信号轴在胰腺癌进展中的作用得到了大量研究证实，circ_0006215通过对miR-378a-3p的海绵作用，减弱其对促癌靶基因SERPINA4的抑制，进而促进胰腺癌细胞的增殖，这项研究首次证明circRNA可用作胰腺癌的miRNA海绵，调节肿瘤相关基因的表达[21]。在此基础上，有实验研究通过高通量芯片分析发现hsa_circ_0000977在胰腺癌组织中异常上调，这也得到了qRT-PCR的验证，沉默hsa_circ_0000977后可以通过增强miR-874-3p的作用和抑制PLK1的表达来抑制胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)细胞的增殖，并使细胞周期阻滞，抑制其在体内生长，在许多癌症中，PLK1的过表达常与更差的预后有关[22]。Hao等[23]也发现在胰腺癌细胞中上调circ_0007534可促进其增殖，并通过对miR-625和miR-892b的海绵作用抑制细胞凋亡，其机制可能是通过调节基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2的表达实现。丝氨酸蛋白酶3(PRSS3)作为一种致癌基因，在胰腺癌中显著上调，研究表明circ-ADAM9通过对miR-217的海绵作用，减轻了miR-217对PRSS3的抑制作用，提高PRSS3的表达水平，从而激活细胞外信号调节激酶/血管内皮生长因子(ERK/VEGF)信号通路，低miR-217或高circ-ADAM9表达的病人比高miR-217或低circ-ADAM9表达的病人生存时间短，circ-ADAM9沉默或miR-217过表达明显延缓了肿瘤的生长，两者的联合对肿瘤的致瘤性具有抑制作用[24]。另一项研究[10]表明circ_100782在胰腺癌中上调，并通过与miR-124结合增加下游白细胞介素6受体(IL-6R)和非受体型酪氨酸激酶2(JAK2)和STAT3的表达，从而促进胰腺癌BxPC-3细胞的增殖。此外，hsa_circ_001653在PDAC中上调，通过RNA干扰沉默PDAC细胞中的hsa_circ_001653可以抑制细胞活力、细胞周期进展、体外血管生成等，表现出促凋亡作用，其机制为沉默hsa_circ_001653可以通过增强miR-377抑制同源框C6功能的能力来抑制PDAC的进展[25]。比较特殊的是，hsa_circ_0001649在胰腺癌细胞系中表达下调，且其低表达常伴较高的肿瘤分期和较差的组织分级，外源性给予hsa_circ_0001649可以抑制胰腺癌细胞的增殖能力，说明其可作为外源性肿瘤治疗药物[26]。

2.circRNA与胰腺癌的侵袭及转移 胰腺癌中有些circRNA出现表达程度的异常可能与侵袭及转移有关。Yang等[27]发现hsa_circ_0006988在胰腺癌组织和血浆中显著升高，其在胰腺癌组织中的表达水平与肿瘤血管浸润、淋巴转移以及T分期密切相关，其在血浆中的表达水平与CA19-9水平、N分期、血管浸润及淋巴转移密切相关，hsa_circ_0006988的表达水平越高往往提示更差的预后；此外，胰腺癌病人早期hsa_circ_0006988表达水平就有升高，hsa_circ_0006988与CA19-9这两项指标联合在胰腺癌的早期诊断中有较高应用价值。研究[28]表明，hsa_circRNA_0007334可能作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，通过吸附hsa-miR-144-3p调节MMP7，提高其表达水平，在PDAC中发挥重要作用，并在体外试验中得到证实，先前的研究发现MMP7的高表达与转移性PDAC密切相关[28]。有研究[29]分析了circ-ASH2L在胰腺癌临床组织中的表达情况，发现miR-34a可在多种肿瘤中调控Notch1的表达，Notch1信号通路可在包括PDAC在内的多种肿瘤中促进侵袭、迁移或血管生成,而circ-ASH2L通过对miR-34a的海绵作用，调控Notch 1的表达，circ-ASH2L增加了Notch 1的表达，而miR-34a降低了Notch 1的表达，并且在Capan-1与Aspc-1这两种细胞系中，circ-ASH2L可以恢复miR-34a介导的抑制作用,最后，该研究还发现circ-ASH2L高表达与淋巴浸润以及更高的TNM分期有关[29]。上皮细胞向间充质细胞的转变最初被描述为上皮细胞获得迁移特性的过程，其特征是上皮标志物的抑制和间充质特性的出现，上皮细胞-间充质转化(EMT)可以在成人中作为对刺激(如损伤)的反应而被重新激活，也可以在器官纤维化和癌症进展期间被激活，发生EMT的细胞不仅具备了迁移的能力，而且还伴随着细胞周期的退出和对凋亡的抵抗而发生了许多变化，以实现分离和远端器官的定植。研究[30]发现，circBFAR通过对miR-34b-5p的海绵作用，上调了EMT激活转录因子(EMT-TFs)的表达，在很多癌症中EMT-TFs信号通路经常发生失调，既往研究表明，EMT-TFs经常过度表达，并在PDAC的进展中发挥重要作用，circBFAR的过度表达增加了EMT-TFs的表达，使下游的AKT(Ser 473)磷酸化，进一步激活了MET/PI3K/Akt信号通路，最终促进了PDAC的转移，抑制EMT已成为一种有前途的胰腺癌治疗方法[30]。外泌体可由肿瘤细胞分泌并可作为细胞间传递信号的信使，Li等[31]发现，胰腺癌病人血浆外泌体富含circ-PDE8A，与肿瘤进展及预后相关，此外，一项深入的研究发现circ-PDE8A可以通过竞争性结合miR-338激活MACC/MET/ERK信号通路，促进肿瘤转移。比较特殊的是，Zhang等[32]发现hsa_circRNA_001587在胰腺癌细胞系中表达下调，而miR-223高表达，研究表明，hsa_circRNA_001587通过对mir-223的海绵作用，解除后者介导的溶质载体家族4成员4抑制作用，抑制胰腺癌的细胞迁移、侵袭、血管生成和肿瘤发生，然而hsa_circRNA_001587的低表达则起相反作用。

3.circRNA与胰腺癌的耐药 circRNA也可能在胰腺癌对化学药物的耐药性方面起到举足轻重的作用。吉西他滨耐药是目前晚期胰腺癌化疗的主要问题，耐药被认为是由药物代谢改变或癌细胞凋亡减少引起的，Xu等[33]证实了circRNA在对吉西他滨有抗性的和正常的胰腺癌细胞系中表达谱存在差异，他们认为circRNA可能作为miRNA海绵影响丝裂原活化蛋白激酶和雷帕霉素靶蛋白信号通路，从而使得胰腺癌产生耐药。同时，Shao等[34]在胰腺癌中构建了对吉西他滨有抗性的细胞系(PANC-1-GR)，分析了PANC-1-GR和PANC-1的circRNA表达谱差异，鉴定了两组间差异最大的两种circRNA(chr14:101402109-101464448 +，chr4:52729603-52780244 +)，这两种circRNA可能通过吸附miR-19a-3p和miR-145-5p使后两者表达下调而起作用，发现沉默它们的表达可以恢复胰腺癌耐药细胞株的敏感性，而过表达则会降低敏感性。近期有证据表明，RAS相关结构家族基因1(ras association family member1，RASSF1)参与了凋亡信号传导、微管稳定和有丝分裂进展等多种生物学过程，并且RASSF1在对西吉他滨有抗性的胰腺癌组织中表达升高，研究发现，circHIPK3通过对miR-330-5p的海绵作用，降低后者与RASSF1 3′-UTR的结合使RASSF1表达升高来调控肿瘤发生，并提升胰腺癌对西吉他滨的抗性[35]。

三、总结与展望

circRNA因其拥有共价闭环的稳定结构，比线性RNA更加稳定，且广泛分布在真核生物体内，且其在进化上高度保守，在表达方面具有一定的组织特异性和时间特异性，使得其具有成为各种疾病包括肿瘤在内的标志物和靶向治疗作用位点的潜质。最近关于circRNA的研究逐渐揭示了它们在肿瘤进展中的各种作用。circRNA最常见和重要的功能是作为miRNA海绵，通过circRNA-miRNA-mRNA轴上调或下调基因表达，影响肿瘤进展。circRNA在胰腺癌诊断和治疗中的研究刚刚起步，并获得了一定的进展。此外，深入研究表明，circRNA在胰腺癌中可以与miRNA结合，通过多种信号轴上调或下调miRNA下游靶基因的表达水平，从而调控胰腺癌肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移和化疗耐受等行为。这表明circRNA在胰腺癌中发挥着多种作用，此外，对这些信号通路的研究可以成为寻找胰腺癌治疗靶点的基础。然而，circRNA在胰腺癌中的研究领域，目前仍缺乏有说服力的动物实验和临床研究来证实circRNA在临床治疗中的作用。因此，circRNA在胰腺癌中发挥的作用及其机制仍需深入研究。我们相信，在不久的将来，circRNA将有利于胰腺癌的早期诊断和靶向治疗。