遗传因素参与新生儿坏死性小肠结肠炎发病的研究进展*

郭 露 综述，李禄全 审校

(重庆医科大学附属儿童医院新生儿诊治中心/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地/儿科学重庆市重点实验室，重庆 400014)

新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)是新生儿尤其是早产儿常见的严重疾病，目前认为NEC的发生可能与早产、低出生体重、肠内喂养、肠道菌群失衡、感染、围生期窒息等有关[1]。近年研究发现NEC发病风险因种族而异，如早产人群中瑞士和奥地利的发病率较北美和爱尔兰低，非裔美国人婴儿比白种人更易患NEC，进一步研究表明NEC发病还与遗传因素密切相关[2]。利用候选基因法，研究者们发现了许多与NEC相关的基因，例如既往研究发现Toll样受体 4(TLR4)通路与NEC发病密切相关，动物研究表明TLR4突变小鼠NEC发病率降低，对NEC患儿进行研究亦发现与TLR4相关的基因变异与NEC发病率及严重程度相关，类似的研究发现如核苷酸结合寡聚化结构域蛋白受体2(NOD2)、甘露糖结合凝集素(MBL)等信号通路及生长因子、炎症因子、氧化应激相关基因突变也与NEC发病密切相关。随着全基因组测序及二代测序的不断发展，少部分研究采用全基因组测序的方法对比NEC与其他疾病患者的全基因组信息，发现存在极大差异，越来越多与NEC相关的遗传信息正在被破译[3]。本文综述近年来发现的基因突变参与NEC发病的研究进展如下。

1 模式识别受体(PRR)及相关信号通路变异

PRR是识别病原体中保守结构基序并激活肠道免疫反应的先天免疫受体，在肠道对共生生物的免疫耐受、对入侵病原体的免疫激活及肠道炎症调节中起关键作用，PRR通过一系列复杂的信号通路发挥免疫作用。因而大量与NEC相关的遗传研究集中在PRR及信号通路相关的基因，包括Toll样受体、NOD2、MBL途径。

1.1TLR突变 TLR通路在肠道的先天免疫调节及识别病原体、清除细菌、诱导炎症细胞和肠道干细胞的增殖和迁移等过程中起重要作用，其家族有10多个成员，分别在肠道不同细胞中表达，对细菌、病毒和真菌的各种成分有明确的特异性，其中最有特色的成员是TLR4。TLR4是革兰阴性菌表明的脂多糖(LPS)的受体，在健康肠道中低表达，与细菌LPS结合后引起的细胞反应极低，从而降低由肠道共生菌引起的局部炎性反应[4]。动物研究表明，TLR的表达在大鼠出生后受到抑制，从而利于肠道菌群的建立。给大鼠胎儿或新生大鼠口服LPS有高致死率，而1月龄的大鼠对大剂量的LPS有更高的耐受力，在患NEC的人和小鼠中，肠道TLR4的水平显著升高。TLR4突变型小鼠(C3H/HeJ)比野生型小鼠(C3HeB/FeJ)的NEC发病率明显降低。白细胞介素-1(IL-1)受体相关激酶(IRAK)为TLR信号通路中的一员，经IRAK抑制剂干预后，实验动物NEC症状减轻，病理明显改善，NEC发生率明显降低[5]。基于动物研究结论，研究者们利用候选基因法对极低出生体重儿的TLR4单核苷酸多态性(SNP)进行研究，发现与TLR4相关的SNP携带者与极低出生体重儿发生NEC的风险无关，随后的早产儿队列研究中亦发现与TLR受体(TLR2、TLR4、TLR5和TLR9)、IRAK1相关的SNP与NEC没有明显关系[6]。但随着对TLR基因更深入的认识，最近的研究发现携带有TLR4信号通路的另一个受体——髓样分子-2(MD2)变异(RS11465996)的婴儿发生需要外科手术治疗的NEC的风险明显升高[7]。TLR相关基因突变主要影响TLR及其受体的表达，动物研究发现TLR突变显著影响NEC的发病，但在早产儿研究中发现TLR受体相关的SNP与NEC发病无明显关系，可能是因为这些研究依赖于目前已知的基因变异，而与NEC发病相关的TLR突变还未被发现，且目前研究样本量均较小，需要更深入及大样本量的研究加以验证和解释，MD2变异婴儿发生需要外科手术治疗的NEC风险明显升高，但其机制目前尚不清楚，有待进一步研究。

1.2TLR负调节因子突变 单个免疫球蛋白IL-1受体相关分子(SIGIRR)是IL-1和TLR信号的负调节因子，可抑制TLR活化、增强肠道对细菌的免疫耐受，肠道SIGIRR的丢失可能导致病原体介导的TLR4过度激活，从而导致NEC的发生，利用全外显子测序和Sanger测序相结合对18例NEC早产儿的SIGIRR编码区进行测序，发现11例均有错义突变，其中的先证者一对双胞胎同时具有相同的终止突变(p.Y168X)和罕见的错义突变(p.S80Y)，而在20例无NEC的早产儿中没有发现相同的突变[8]。动物研究发现，利用低氧、喂养配方奶、LPS给药诱导SIGIRR-/-和SIGIRR+/+的小鼠发生实验性NEC，SIGIRR-/-小鼠的肠道炎症因子的表达明显更高，肠道损伤程度更严重，且与TLR通路的激活有关，表明新生肠道中SIGIRR的丢失会导致肠道炎症加剧和NEC易感性增加[9]。尽管没有直接证据表明TLR基因突变与NEC发病相关，但是TLR的负调节因子SIGIRR可能是有前途的NEC候选基因。

1.3NOD2变异 NOD2是一种与先天免疫相关的细胞内PRR，能抵抗病原体入侵，促进细胞凋亡，诱导细胞因子和炎症因子的产生，NOD2功能多态性与肠道炎症性疾病密切相关。动物实验发现NOD2通过抑制TLR4的激活减轻肠道细胞的损伤，从而减轻NEC的严重程度，故NOD2可能与SIGIRR类似，均通过抑制TLR影响NEC的发病[10]。既往研究对小样本早产NEC患儿进行NOD2基因测序，未发现NOD1和NOD2的变异与NEC发病相关，这可能与样本量小，NOD2基因突变率低有关。最近一项纳入了9 000多例欧洲极低出生体重儿的基因分型研究中发现存在两个或多个NOD2功能缺失的婴儿需要手术治疗的NEC风险显著增加[11]，这可能与NOD2功能缺失对TLR4的抑制作用减弱有关，使NOD2功能缺失的基因变异可能会增加NEC的严重程度，使NOD2功能增强的基因变异是否会减轻NEC严重程度目前尚少见相关研究报道。

1.4MBL突变 MBL是一种循环模式识别分子，通过识别入侵病原体的特殊碳水化合物成分激活补体系统诱导其吞噬作用清除病原体，MBL水平的改变与感染、早产儿神经发育不良、炎症性肠病和NEC相关。最初的研究对早产儿MBL-2基因第一外显子基因进行检测，发现MBL-2基因第54位和57位突变者发生败血症、动脉导管未闭的风险明显高于野生型，而与NEC无关[12]。随后一项纳入了107例胎龄<32周的早产儿(NEC 41例)的研究中，研究者通过检测MBL-2基因型、血清MBL水平及NEC手术者肠组织MBL表达水平，发现MBL-2基因54位和57位密码子突变与NEC无关，而在启动子(-221 X/Y)的单核苷酸多态性与NEC发病明显相关，且NEC患儿血清MBL水平明显升高，严重NEC中MBL-2基因及肠组织中MBL表达水平更高[13]，另外的研究亦发现MBL-2突变型(第54/57/52位密码子突变)患儿血清MBL水平明显低于野生型，NEC患儿的患病率低[14]。血清MBL是循环模式识别分子，可以通过识别TLR-2/6/4而调节炎症因子的产生[15]，MBL-2基因不同位点的变异对血清MBL水平有不同的影响，目前研究表明血清MBL水平与NEC发病率及严重程度呈正相关。

2 其他基因变异

2.1自噬相关基因(ATG16L1)突变 ATG16L1位于2q37.1染色体上，编码蛋白质Atg16L，参与形成自噬体，自噬体对于组成吞噬病原体的溶酶体至关重要，研究表明ATG16L1突变与肠道炎症性疾病如克罗恩病密切相关，在NEC发病过程中，ATG16L1诱导的自噬使NEC的肠道损伤更严重，而ATG16L1的减少可以降低NEC的发病率[16]。通过对NEC与非NEC早产儿的ATG16L1基因进行分型发现其突变体——Thr300Ala与低NEC发病率相关，这可能是因为该突变增加了ATG16L1对caspase-3介导的降解反应的敏感性，导致自噬减少，从而降低NEC的发病率。同时，该项研究复制的独立队列研究(260例婴儿，23例NEC患儿)也表明ATG16L1不同基因型间NEC发病率有明显差异，这为该基因在NEC中的重要性提供了进一步的证据[17]。目前研究表明ATGL1基因的突变可能通过影响Atg16L蛋白的水平，从而影响自噬体的形成，进而影响NEC的发病及严重程度，但ATGL1不同基因突变与NEC发病的具体机制尚不清楚，有待进一步研究。

2.2核因子κB(NF-κB)基因突变 NF-κB是主要的转录因子，可调节TLR、NOD和IL途径，抑制NF-κB可以减轻缺血缺氧所致的肠道损伤，NF-κB受抑制蛋白(IκB)调节，该蛋白与细胞质中的NF-κB结合，阻止其进入细胞核而抑制炎症基因的表达，未成熟肠上皮细胞的IκB水平较低，导致对NF-κB抑制作用降低。通过动物研究中检测围产期大鼠和新生NEC大鼠模型的NF-κB活性程度，研究者发现大鼠肠道NF-κB在出生时就被强烈激活，喂养母乳的新生大鼠在1 d内下调，受到缺氧等应激因素影响的大鼠第2天仍保持较高活性，并且内源性NF-κB抑制蛋白IκB水平显著降低，表明NF-κB过度激活促进了NEC的发展，药物实验发现给予大鼠抑制NF-κB活性的药物能降低肠道损伤程度[18]。分别对NEC与非NEC患儿进行基因检测发现，在所有NEC患儿中均存在NF-κB1(g.-24519delATTG)变异，而非NEC患儿中仅占65%，差异有统计学意义(P=0.003)，相反，NF-κB1抑制基因——NF-κBIA(g.-1004A>G)变异在NEC患儿中的检出率为13.3%，而在非NEC患儿中的检出率明显升高达49%，差异有统计学意义(P<0.05)[6]。在NEC发病过程中，NF-κB进入细胞核介导炎症通路的表达，使NF-κB表达增强的基因变异可能是NEC发病的必要因素，而NF-κB1抑制基因表达增强的变异对NEC具有保护作用。

2.3血小板活化因子(PAF)基因突变 PAF是有促炎作用的内源性磷脂，活化后可导致白细胞和血小板聚集、上皮细胞损伤、凋亡、血管收缩及肠道黏膜通透性增加、紧密连接受损，在NEC致病过程中起着重要作用。在循环中PAF可被PAF乙酰水解酶(PAFAH)降解。动物实验发现给大鼠输注PAF能使其发生肠坏死，而肠内注射PAFAH可以使NEC发病率显著降低[19]。母乳中含有大量的PAFAH，而且早产儿母乳中PAFAH活性持续的时间更长。研究发现敲除了PAFAH基因的幼鼠在生后早期发生与细菌感染和窒息相关的死亡率降低，但后期发生NEC的概率明显升高，基于这些研究，一项对570名早产儿(Ⅰ期或Ⅱ期NEC 36例)的PAFAH基因变异进行检测，发现NEC与非NEC患儿中PAFAH基因变异率没有显著差异。但这项研究将Ⅰ期和Ⅱ期NEC均纳入实验组，且NEC组样本量小，另一项国内研究评估了使PAF失活的另一个拮抗剂——高尔基体α-甘露糖苷酶2激活蛋白(GM2AP)的单核苷酸多态性，纳入了125例婴儿，其中NEC 42例，发现NEC发病与GM2AP的2个变体rs1048719、rs2075783存在正相关[7]。然而，该项研究中没有区分足月儿和早产儿，难以确认检测到的差异是由于早产还是NEC。动物实验表明PAF相关基因与NEC发病密切相关，但PAF相关基因在人类疾病中的作用及其突变与NEC的关系尚需进一步研究。

2.4凝血相关基因突变 NEC中常见凝血障碍和肠系膜血栓形成，抑制凝血酶可以减轻NEC的肠道损伤[20]，研究者测定了NEC患儿与同体重和胎龄的健康组和败血症组的凝血相关基因，发现NEC组12个凝血和抗凝相关基因发生了显著改变[21]。

2.5生长因子相关基因突变

2.5.1血管内皮生长因子(VEGF)相关基因 肠道缺血是NEC发病的危险因素，NEC的组织学特征是肠道全层缺血凝固性坏死，最近的研究表明肠黏膜微血管系统发育不良在NEC发病中起重要作用。而正常VEGF信号传导过程对于微血管的发育和维持及缺血后的血管恢复是必不可少的。VEGF家族成员中VEGFA是血管生成的关键因子，与内皮细胞的血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合，从而促进内皮细胞增殖、迁移、分化和血管形成[22]。研究发现VEGF及VEGFR2在出生前3 d的肠道中高表达，在生后显著降低[23]。上调小鼠肠上皮细胞VEGF的表达，促进内皮细胞增殖，对肠道具有保护作用。反之在实验NEC鼠中，利用VEGFR2特异性激酶抑制剂处理新生小鼠幼崽，小鼠肠道坏死程度更严重，死亡率更高[24]。

最初的研究评估了NEC中的VEGF多态性，发现携带有VEGF-2578等位基因突变倾向于降低VEGF的产生，与NEC发病风险增加相关[25]。一项在中国汉族人群中的研究亦发现在VEGFA的单核苷酸多态性中，rs699947和rs833061与血浆低VEGFA水平与高NEC发病率显著相关[26]。而国外研究发现VEGFC-2578A的SNP中rs699947与NEC发病没有明显相关性，可能与不同种族人群基因变异率不同有关[27]。

2.5.2肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)基因 HB-EGF对实验性NEC的肠道具有保护作用[28]。研究者检测了30例早产NEC患儿和80例对照组患儿的5个HB-EGF SNP及其血浆水平，发现NEC患儿血浆HB-EGF水平降低，rs4912811遗传变异与低血浆HB-EGF水平和高NEC风险相关[29]。

2.6炎症因子相关基因突变 发生NEC的早产儿血浆和肠道组织中炎性细胞因子的水平升高，表明炎性细胞因子在NEC发展过程中可能发挥了促进作用。研究发现NEC患儿中TLR4、NF-κB、诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子-α、IL-6、IL-10表达上调[30]。但是，尚不清楚这种增加的细胞因子是NEC的促进因素还是对NEC发生的反应。已有研究检测了细胞因子基因多态性与NEC的关系，发现肿瘤坏死因子-α和IL-1β、IL-4受体α链、IL-6、IL-18和IL-10的功能变异与NEC无明显关联[31]。一项更大样本量的研究发现高加索新生儿IL-6(rs1800795)变异体与NEC呈正相关，在这项研究中纳入的均为Bell Ⅱ期以上的NEC早产儿，对NEC的定义更精确，这可能是得出不同结论的原因。因此，需要更大样本量更严格的研究来验证这一发现。另一方面，在炎症信号通路的抑制途径中发现双重特异性磷酸酶(DUSPs)基因变异与严重NEC相关。DUSP是促分裂原激活的蛋白激酶，能抑制炎症信号通路。研究发现DUSP-6基因rs704074变异发生需要外科手术的NEC风险明显降低[32]。

2.7氧化应激相关基因变异 肠道缺血再灌注损伤会产生活性氧(ROS)。ROS是细胞功能的重要介质，被抗氧化剂系统中和，成熟肠道中自由基和抗氧化剂之间存在微妙的平衡。而早产儿抗氧化酶水平和活性相对缺乏，当ROS的产生超过抗氧化能力，或当抗氧化系统缺陷时，就会发生氧化应激(OS)，OS对组织和细胞均有损伤，包括膜脂质过氧化，蛋白质功能和结构的改变及DNA损伤，导致肠道的损伤和炎症形成。OS水平与NEC的发病及严重程度相关，肠内喂养时，新生儿肠上皮细胞清除ROS的能力降低也会促进NEC的发生，因此推测抗氧化剂基因的功能性SNP影响早产儿NEC的发病风险。通过对比早产儿NEC和自发性肠穿孔全基因组差异，发现在NEC中OS基因表达发生了显著变化[33]，基于这些研究，HUIZING等[34]进行了候选基因关联的初步研究，发现在早产儿NEC与非NEC组中已知的6个抗氧化基因[NFE2L2 (Rs6721961)、SOD2 (Rs4880)、GSTP1 (Rs1695)、NQO1 (Rs1800566)、GCLC (Rs17883901)和Hmox1 (Rs2071747)]的功能SNP没有明显差异，但随后的研究发现与OS相关的另一个基因——编码细胞色素B-245α链(CYBA)的C242T多态性与NEC发病风险相关。目前，OS基因与NEC发病的研究主要依靠候选基因法，研究结论受到人们对基因认识水平的限制。

3 结 语

与NEC相关的遗传因素研究目前主要集中在调节PRR表达及相关信号通路的细胞因子表达水平上，主要采取的方法为候选基因法，评估一些可能与NEC发病相关的基因变异，然后选择NEC患儿与非NEC患儿进行对照研究，因此研究结论受到NEC诊断分型标准、样本量、不同种族人群遗传差异及对基因功能认识程度等因素影响，亦有研究者对早产儿进行了全基因组关联研究，发现了多个与NEC显著相关的基因变异，但这些基因的意义及导致NEC发病的机制仍有待进一步研究。未来的研究应在严格控制纳入标准，充分考虑NEC诊断分型、种族来源等影响因素的基础上进行更大样本量更深入的研究，进一步探讨遗传因素与NEC发生的机制，期望未来能通过遗传因素预测NEC的发生及严重程度，进行早期预防、早期诊断并能进行更加有针对性的治疗，从而降低NEC的发病率和死亡率，改善NEC患儿的预后。