RGMa在多发性硬化中的研究进展*

汤金华，杨 军，鞠 露 综述，冯金洲 审校

(重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆 400016)

多发性硬化(MS)是一种中枢神经系统(CNS)炎性自身免疫性疾病，主要病理表现为炎性细胞浸润、脱髓鞘继而轴突破坏。发病以青少年多见，常导致永久性躯体功能残疾，是30岁以下年轻人最常见的致残性CNS疾病之一，全世界超过250 万例患者，给家庭和社会造成沉重的负担[1]。然而，目前MS具体发病机制未明，缺乏生物学标志物，阻碍靶向治疗的临床应用。目前研究表明，排斥性导向分子a(RGMa)可能参与CNS多种疾病的病理机制，尤其是MS的发病[2-3]。

1 RGMa分子结构

RGMa属糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的蛋白家族成员，最早被发现于鸡胚胎视觉系统，具有轴突导向功能[4]。目前在脊椎动物中发现排斥性导向分子(RGMs)家族成员主要有RGMa、RGMb和RGMc 3种形式，RGMa和RGMb以基本上不重叠的方式主要表达于CNS及其他组织(心脏、肺、肝脏、皮肤、免疫系统及小肠等)，而RGMc 仅表达于骨骼肌、肝脏和血液。RGMa基因定位于15q26.1号染色体，所编码蛋白含450个氨基酸，具有GPI锚定的C端、N端信号肽，RGD基序及部分von Willebrand D型(vWFD)结构域4个组成部分。RGMa以可溶性、膜结合形式存在于神经元、髓鞘等CNS结构[5]。

2 RGMa的信号传导通路

RGMa同1型跨膜蛋白Neogenin结合，主要经Rho-Rho激酶途径，发挥轴突引导或神经元存活、血管生成等生物学功能；RGMa的C端结构域(C-RGMa)和RGMa的N端结构域(N-RGMa)激活了不同的细胞内途径来调控上述功能：通常C-RGMa与Neogenin结合可通过Unc5和LARG激活RhoA，C-RGMa通过RhoGEF(LARG)/Rho/Rock途径抑制轴突生长；通过黏着斑激酶(FAK)和p120 RasGAP灭活Ras，从而诱导生长锥塌陷[5-6]。而C-RGMa与Neogenin的结合抑制了Lrig2和Neogenin之间的相互作用，ADAM17可切割Neogenin，以使神经元对RGMa不敏感;N-RGMa依赖于β分泌酶切割Neogenin的细胞内部分，以生成细胞内结构域，该结构域通过结合LIM蛋白4(LMO4)来阻止神经生长[5-6]。在上皮细胞中，Neogenin结合并定位WAVE调节复合物(WRC)，导致肌动蛋白在Arp2/3复合体的帮助下成核并进一步聚合为微丝，同时需要Rac1来激活和稳定的黏附连接，该通路可调节细胞间黏附连接，维持CNS发育的保真度[5]。此外RGMa作为骨形态发生蛋白(BMPs)的共受体，可作为BMP和Neogenin之间的结构桥，可与BMP-2、BMP-4等分子结合后通过BMP-BMP受体通路，诱导BMP受体复合物的内吞作用，从而激活经典的SMAD信号传导，参与铁代谢、骨骼发育、轴突再生等过程[7-8]。

3 RGMa的生物学活性

3.1细胞增殖与分化 RGMa与Neogenin均在肠道神经干细胞增殖及分化过程中高表达，二者任一缺失会引起肠道系统神经元、神经节、胶质细胞减少，表明RGMa参与细胞增殖与分化[9]。

3.2细胞黏附与迁移 RGMa可提高离体胚胎的细胞间黏附作用；RGMa过表达的早期胚胎的外胚层细胞出现迁移缺陷，表明RGMa与细胞黏附、迁移相关[8]。

3.3神经发生与神经管闭合 RGMa与Neogenin结合后可调节胚胎神经发生中的分化和迁移，在体外RGMa与Neogenin可共同调节成人CNS发生[10-11]。RGMa诱导Neogenin蛋白水解促进神经管形态发生，耗竭RGMa可引起神经管闭合缺陷[12]。

3.4调控神经元存活 敲除齿状回中的RGMa可增加新生神经元的数目。有学者认为RGMa与神经干细胞上的Neogenin结合，通过调控caspase-3、ROCK、死亡相关蛋白激酶(DAPK)和LMO4等调节CNS神经元存活[10-11]。

3.5抑制突触形成 RGMa可通过干扰皮质神经元中突触前蛋白synapsin-1与突触后蛋白PSD-95的同区域表达以阻碍突触形成；抑制RGMa可使以上两种蛋白的共表达提高，从而提高脊髓损伤后的突触形成[13]。

3.6生长锥塌陷及轴突生长抑制 RGMa可能通过诱导RhoA和ROCK在CNS损伤后起到轴突生长抑制作用[5,14]。RGMa通过激活Rho-kinase及GSK-3β通路调控塌陷反应介体蛋白-2(CRMP-2)的磷酸化，导致生长锥塌陷[15]。抑制RGMa可以促进脊髓损伤后轴突生长和运动恢复[13,16-18]。

3.7免疫调节 RGMa可通过树突状细胞(DCs)调节T细胞活化和自身免疫反应，促进炎症细胞的CNS浸润[19]。用RGMa中和抗体处理，可让DCs发挥耐受性和免疫调节功能，降低主要组织相容性复合体-Ⅱ(MHC-Ⅱ)、CD86、CD80和CD40水平，从而减轻自身免疫反应[20]。

3.8抑制新生血管形成 RGMa与血管内皮细胞上Neogenin结合，可降低磷酸化FAK水平、下调血管内皮生长因子(VEGF)、抑制 F-肌动蛋白，从而明显降低内皮细胞的增殖、迁移和血管生成[5,21]。RGMa在体外、体内均可抑制血管生成[21-22]。

3.9调控血脑屏障(BBB)通透性 沉默RGMa表达可改善BBB破坏，从而减少脑梗死大鼠梗死、水肿体积，推测RGMa可能通过CDC-42/PAK-1信号通路参与了BBB功能障碍[23]。

4 RGMa在MS中的研究进展

4.1RGMa在MS中的表达 研究发现MS动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠发病后RGMa水平明显升高，并且在继发进展型MS(SPMS)小鼠模型中，处于疾病继发进展阶段小鼠的脊髓RGMa的表达也明显高于对照组，与急性阶段的表达水平相比，仍无明显下降，表明RGMa参与EAE小鼠的急性发病与继发进展[3]。DEMICHEVA等[7]发现SPMS患者CNS急、慢性损伤斑块及正常样白质均伴有RGMa表达的显著升高。基线血液中RGMa表达水平与MS患者随访扩展残疾状态量表(EDSS)变化呈负相关，表明血RGMa的表达与MS神经功能缺损相关，RGMa有望作为MS临床监测的生物标志物，指导临床治疗[2]。

4.2RGMa中和抗体在MS治疗中的潜在作用 RGMa中和抗体在体内、体外均可抑制RGMa的表达，目前多项研究表明在多种MS动物模型EAE小鼠中，RGMa中和抗体可通过阻断RGMa改善疾病神经功能评分，减轻髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)诱导的EAE的临床严重性，减少髓鞘蛋白脂质蛋白(PLP)诱导的EAE的复发，抑制继发进展型EAE的进展，并从多个方面改善EAE的病理反应[3,5]。目前研究表明RGMa中和抗体可能主要从以下方面发挥治疗作用。

4.2.1减轻炎性反应 用抗RGMa抗体治疗急性、慢性EAE小鼠可减少CD4+T细胞等炎症细胞向CNS的入侵，减少EAE小鼠CNS中INF-γ、IL-2、IL-17、IL-4等炎性细胞因子的表达水平，减轻炎性脱髓鞘程度，抑制CNS的炎性反应，减轻致病性Th17诱导的神经元损害[3,5]。在人类中，RGMa特异性抗体可降低患有MS个体的外周血单个核细胞(PBMC)中的T细胞增殖和促炎性细胞因子的产生[5,24]。

4.2.2减轻神经变性及增强轴突与髓鞘再生 用RGMa特异性抗体对脊髓炎型EAE大鼠进行全身治疗，可增强炎性病变轴突再生的能力，并产生髓鞘再生迹象[7]。此外，人源化抗RGMa单克隆抗体治疗继发进展型EAE小鼠，可保留髓磷脂，抑制脱髓鞘和轴突变性，并促进皮质脊髓束(CST)的轴突生长和运动恢复，从而抑制疾病进展[3]。在视神经炎型EAE模型中，系统性应用RGMa特异性抗体可显著减少视网膜神经纤维层(RNFL)的变性[7]。抗RGMa治疗有非常强的神经保护作用。

4.3RGMa在MS中的发病机制 RGMa会高表达于MS损伤部位，通过特异性中和RGMa，神经功能进一步恢复，表明RGMa可作为MS有前景的生物标志物及治疗靶点[2-3]。最近研究表明RGMa在MS的病理过程中具有重要作用，但具体机制尚不确切，RGMa在MS中可能的发病机制包括以下几方面。

4.3.1介导免疫细胞信号转导异常 在MS中，免疫细胞会渗透到CNS，其中细胞免疫发挥主导作用，从而导致脱髓鞘、轴突损伤和神经功能障碍等[25]。CD4+T细胞是CNS炎症的关键效应细胞，目前普遍将分泌INF-γ的CD4+Th1细胞作为MS异常自身免疫反应的关键[6]。 目前研究发现RGMa的阻断抗体不但能减少T细胞的增殖，而且可增强Th1细胞向具有自身免疫抑制作用的Th2细胞的转化，RGMa在MS免疫反应中的新作用最近备受关注[20]。

RGMa-Neogenin信号通路可参与MS中T细胞介导的自身免疫过程[3]。具有较强抗原递呈功能的骨髓来源的DCs可表达RGMa，而Neogenin由CD4+T淋巴细胞表达，抗原递呈细胞的RGMa与CD4+T细胞的Neogenin结合诱导了小GTPase Rap1的激活，从而增加了对细胞内黏附分子1(ICAM-1)的黏附，因此，与Neogenin诱导的生长锥塌陷(导致黏附力迅速丧失)相反，RGMa和Neogenin在免疫细胞上的结合可以触发增强的附着力，ICAM-1黏附的增加可促进免疫细胞向MS脑的侵袭，增强CNS炎性反应[19]。CD4+T细胞在SPMS和慢性EAE的慢性神经炎症中也发挥着重要作用，抗RGMa抗体治疗可显著减少继发进展型EAE小鼠脊髓切片中的细胞浸润，并通过流式细胞术分析确定抗RGMa抗体可减少脊髓中CD4+T细胞和小胶质细胞的数量[3]。

目前研究发现RGMa在EAE中可诱导T细胞活化，激活后的T细胞可穿透BBB,大量分泌炎性细胞因子，募集更多炎性细胞，引起CNS异常自身免疫反应[5,24]。通过RGMa特异性抗体抑制RGMa的表达，可抑制T细胞反应，能够显著减少EAE小鼠CNS中INF-γ、IL-2、IL-17、IL-4等炎性细胞因子的表达，减轻脱髓鞘程度，缓解神经功能损伤，减弱EAE的严重程度；在人类，RGMa特异性抗体可降低患有MS个体PBMC中的T细胞增殖和促炎性细胞因子的产生，由此推测，RGMa-Neogenin信号转导通路参与MS的T细胞介导的自身免疫过程：抗原递呈细胞中的RGMa与Neogenin阳性的CD4+T结合，从而导致周围神经系统和CNS的CD4+T细胞活化[5,25]。

最近研究表明，CD4+T中产生IL-17的Th17细胞在EAE发病机制中也起着重要作用，IL-17、IL-17受体的缺乏会减少EAE的临床体征，而在包括Th0、Th1、Th17和Treg细胞在内的T细胞亚群中，Th17细胞高度表达RGMa，致病性Th17主要在MS中诱导神经变性：Th17细胞的RGMa与神经元中的Neogenin结合，通过AKT的去磷酸化诱导神经变性，RGMa的中和抗体可减轻轴突变性和Th17细胞介导的EAE的严重程度[24]。

综上，RGMa-Neogenin信号转导通路通过DCs、CD4+T细胞(主要为Th1、Th17)在MS的异常自身免疫中占据重要作用，可作为MS免疫治疗的重要靶点。

4.3.2促进脱髓鞘 脱髓鞘在MS的病理中占据主要作用，在MS的经典动物模型EAE小鼠中，RGMa可通过增强CD4+T细胞的活化，促进CNS脱髓鞘[25]。本课题组前期研究发现利用RGMa中和抗体抑制RGMa表达能减轻EAE小鼠的脱髓鞘水平，抑制神经功能损伤。表明RGMa在EAE中可促进脱髓鞘，而RGMa在MS患者中是否能发挥脱髓鞘作用及RGMa中和抗体是否可减轻MS患者的脱髓鞘情况尚需进一步研究。

4.3.3促进神经变性 神经变性是MS进展的重要因素，在MS中极大影响神经功能恢复，轴突生长与髓鞘再生是目前促进MS功能恢复治疗的热点，在脑和脊髓中存在的RGMa具有强大的抑制再生活性，表明其可能在MS相关的神经变性中起关键作用[7]。研究表明，具有高度炎症活性的小胶质细胞和巨噬细胞在进展性MS中起重要作用，而小胶质细胞可表达RGMa[3]。 用RGMa特异性中和抗体5F9，可结合RGMa的N端结构域，对脊髓炎型EAE大鼠进行全身5F9治疗，可显著且高度可重复地改善神经功能，减少小胶质细胞病变的大小，增强炎性病变轴突再生的能力，可促进脊髓灰质损伤部位及顺行追踪的CST的轴突出芽，并产生髓鞘再生迹象[7,26]。对于SPMS小鼠,抗RGMa抗体治疗可通过抑制少突胶质细胞和小胶质细胞中RGMa表达，抑制脊髓中的轴突变性，降低脱髓鞘作用，并可通过促进损伤部位的CST轴突发芽而发挥再生神经网络的能力，促进运动功能恢复，表明RGMa很可能在MS中具有促进轴突变性的作用，并推测可能通过RGMa-Neogenin通路发挥该作用[3]。

在20%～30%的患者中，MS的最初症状之一是视神经炎，即视神经的炎性发作，这种发作很可能会对形成RNFL的视网膜神经节细胞(RGC)及其轴突产生重大影响[25]。 研究发现在视神经炎型EAE模型中，系统性应用RGMa特异性中和抗体5F9可刺激轴突再生，使再生的轴突生长为炎性病变，显著减少RNFL的变性，对RGC发挥显著而强大的保护作用，还显著增加了破裂视神经中髓磷脂碱性蛋白(MBP)+染色的面积，该表现可作为反映髓鞘再生的公认标志，这表明RGMa不仅参与轴突再生的抑制，而且参与细胞死亡的调控[7,26]。

综上研究表明RGMa(尤其是RGMa的N端结构域)很可能促进MS的再生失败与神经退行性变，但尚需进一步的临床实验来验证RGMa在MS患者中的这一功能。

4.3.4抑制血管生成 血管生成是MS病理生理学涉及的另一个重要因素，在MS炎症性病变中可见新血管形成，血管生成在MS疾病早期可通过消耗过多能量、促进炎症扩展而产生有害作用，但新生血管释放的营养因子可能对功能恢复带来积极作用，如源自新血管的VEGF在EAE的早期阶段表现出促炎作用，但在EAE的晚期阶段参与修复过程；从新血管中产生的前列腺素I2(PGI2)可促进EAE中的运动恢复[24]。而在存在VEGF的情况下，RGMa可通过Neogenin抑制内皮管的形成，从而抑制新血管形成，表明RGMa-Neogenin信号传导途径可通过抑制血管生成影响MS的病理过程[21]。

4.3.5调控BBB通透性 在MS中，BBB的破坏是一个明显且早期的病理特征[27]。RGMa在CNS中具有调控BBB通透性的功能[23]。MLLER等[28]发现，给MS患者鞘内注射曲安奈德，治疗有效患者其神经功能改善程度与脑脊液RGMa水平降低程度呈一致趋势，而治疗无效的患者其脑脊液RGMa水平较治疗前亦无明显改善。同时基于抑制炎性细胞浸润、改善BBB通透性是曲安奈德治疗MS的主要机制之一，推测RGMa可能通过调控MS患者BBB通透性改变参与MS的病理过程[29]。

5 结语与展望

RGMa作为一种轴突导向分子，通过RGMa-Neogenin、RGMa-BMPs等信号通路广泛参与CNS发育与病理过程。RGMa具有调控细胞增殖、分化、黏附、迁移、神经发生、神经管闭合、神经元凋亡、突触形成、生长锥塌陷、轴突生长抑制、免疫应答、新生血管形成、BBB通透性等生物学活性。目前研究发现，RGMa在MS患者和EAE小鼠的CNS中高表达,并可能通过介导免疫细胞信号转导异常、促进脱髓鞘、促进神经变性、抑制血管生成、调控BBB通透性等途径参与MS的发病机制。RGMa中和抗体可通过阻断RGMa减少炎性反应，减轻CNS异常自身免疫，减轻神经变性及增强轴突与髓鞘再生等作用改善EAE的神经功能，表明RGMa可能是治疗MS非常有前景的靶向标志物。但RGMa在MS中的具体发病机制及通过的具体信号通路目前尚未完全明确，缺乏RGMa相关的随机对照临床试验，亟须更深入的机制与通路研究及大样本随机对照临床试验以验证RGMa在MS中的发病机制并指导靶向RGMa的临床治疗。