畜禽类骨胶原蛋白及其肽的研究进展

凌嘉阳 曾晓房

仲恺农业工程学院轻工食品学院 广东广州 510225

1 概述

胶原蛋白是一种纤维蛋白，是大部分动物体内含量最丰富、分布最广的功能性蛋白，也是细胞外基质的主要结构蛋白，主要存在于动物的骨、皮、血管、角膜等其中，是人体中结缔组织最主要的构成物质[1]。胶原蛋白的生理功能和生物活性十分丰富，其含量和质量对人的身体健康状况影响极大。通过适宜的条件对大分子的胶原蛋白进行水解，生成小分子的肽，其既含有胶原蛋白全部的氨基酸，又具有比胶原蛋白更好的吸收性和加工特性，更容易被人体吸收利用。近年来，从胶原肽中分离鉴定出多种具有调节生理功能作用的生物活性肽[2]，如抗氧化肽、抗高血压肽、抑菌肽等。相对于氨基酸以及蛋白质，肽的分子质量较小，细胞透过性较好，易被人体消化吸收，具备良好的溶解性、吸水性、保水性、湿润性、吸油性及起泡性，同时有着一定的乳化性、较弱的凝胶性和泡沫稳定性[3]，且毒副作用极低，从而在食品、药品及医疗等领域都有巨大的开发潜力[4～6]。

2 畜禽类骨胶原蛋白肽的提取工艺

当今已有从各种常见畜禽类骨头如猪骨、羊骨、牛骨、鸡骨和鹅骨中提取胶原多肽的制备工艺，常见的水解方法有酸碱法和酶法等。目前主要的提取方法如下。

2.1 化学水解法

化学水解法主要是酸法和碱法。其原理是加入适当浓度的强酸或强碱溶液破坏蛋白质的肽键，在水浴条件下反应一定时间后终止反应，分离纯化后可得机构较为完整的胶原蛋白。化学水解法操作简单，成本低，同时亦有如水解程度不好控制、容易损害氨基酸、副产物较多等缺点。酸法主要通过在低温条件下用浓度较低的酸溶液如醋酸制造酸性环境，破坏分子间的离子键和希夫氏键，打开含醛胺类交联键，使胶原纤维膨胀和溶解[7，8]，可较好地保留胶原蛋白的天然三股螺旋结构；但其缺点在于会破坏部分氨基酸，且产品得率较低，设备由于腐蚀损坏率较高，存在一定的局限性[9]。何兰[10](2012)采用醋酸制备牛骨胶原蛋白，粗提物脱脂脱钙后先以0.1mol/L醋酸透析2d，后以蒸馏水透析1d，其得率为2.34%；王晓军[11](2018)等采用酸法从牛骨中提取胶原蛋白得率是2.24%，提取的胶原蛋白纤维网状结构较为完整，且与酶法提取相比，酸法提取的胶原蛋白结构分布相对均匀。

碱法通常使用石灰、氢氧化钠、碳酸钠等处理剂破坏含羟基和巯基的氨基酸令肽键水解，产生消旋作用。虽然碱法成本低廉，工艺简易，但极易引起胶原蛋白的变性，对胶原蛋白的三股螺旋结构造成破坏，如果严重水解，会产生消旋作用进而生成有毒物质，有致癌、致畸型、致突变的危害[12]，因此应用并不广泛。

2.2 酶解法

目前畜禽类骨胶原肽最常用的提取方法为酶解法。酶解法反应条件温和，易控制，并且安全性高，成本低，可根据所需功能片段选择相应的酶，在合适酶解条件下水解，利用酶的专一性准确切割到正确的疏水氨基酸处，确保获得具有所选定功能的肽段。

由于不同的肽具有不同的特定功能，因此在采用酶解法制备骨胶原肽时，蛋白酶的选择尤为关键。刘丽莉[13](2017)等将前期分离纯化得到的具有特异性降解牛骨胶原蛋白的胶原蛋白酶作用于牛骨胶原蛋白，最佳酶解工艺得到的水解度为34.98%；酶解法还可使用多种不同的酶对畜禽类骨头进行复合水解，以获得更好的提取效果。王钰慧[14](2016)等利用复合蛋白酶和风味蛋白酶双酶以同步水解和顺序水解的方式水解羊骨粉，发现2种酶的同步水解效果好于顺序水解，双酶同步的水解度可达29.21%，氨基态氮含量为27.29%，其中多肽生成量和短肽得率极显著地高于单酶水解。符群[15](2009)选择碱性蛋白酶及复合风味蛋白酶对鸡骨进行双酶相继水解，最佳工艺条件为先利用碱性蛋白酶水解3h后，再添加复合风味蛋白酶水解4h，制得的鸡骨胶原多肽的水解度为16.68%，羟自由基清除率为58.68%。而Ⅱ型骨胶原蛋白主要是在畜禽动物软骨组织如胸软骨、关节软骨、肋骨里提取，经甲醇氯仿混合脱脂、盐酸胍去多糖、胃蛋白酶酶解等处理，然后经过盐析、透析等方法纯化后进行冻干，即可得到较纯的Ⅱ型胶原蛋白[16～18]。综上所述，酶法制备骨胶原蛋白得率较高，应用较广泛。

2.3 水热抽提和热压浸提

在工业生产里，畜禽骨胶原蛋白也能通过水热抽提、热压浸提提取。水热抽提能将胶原蛋白的三螺旋结构破坏并转化为无规则卷曲状态，所得产物称为明胶，溶解性较高[19]。热压浸提技术的特点是不引入酸碱盐等化学物质，产品得率高。樊晓盼[20](2017)等利用热压浸提制备牛骨蛋白，响应面法优化最佳工艺后，提取率可达64.73%。张永秀[21](2006)等以121℃、30min预处理牛脊椎骨后，利用风味蛋白酶水解制备出低分子量的低聚肽，产物氮溶出率高达95%。在实际生产中，往往通过上述化学水解法、酶法、水热抽提及热压浸提法等联用以提高胶原蛋白及其肽的提取效率，在企业中应用较为广泛。

3 畜禽类骨胶原蛋白的结构

畜禽骨胶原中主要包括骨组织中的I型胶原蛋白和软骨组织中的Ⅱ型胶原蛋白，其中含量最多和分布最广泛的是I型胶原蛋白。胶原蛋白的结构使其具有显著的生物相容性、低抗原性和高细胞粘附性等特性，是作为医用生物材料的理想材料之一[22]。

3.1 I型胶原蛋白

I型胶原蛋白主要存在于骨骼、皮肤、韧带、肌腱和其他器官等，占生物体胶原总量的90%。典型的I型胶原蛋白由2条α1链与1条α2链交互缠绕所构成异源三聚体的结构，具有重复的三肽Gly-X-Y结构域，即(Gly-X-Y)n重复序列及其两侧各有一个NC结构域，然后NC结构域会进一步形成类似球状的结构。作为骨有机质的主要成分，I型胶原蛋白的分子结构非常稳定，抗拉强度高，影响着骨的抗拉强度、钙化后的扭转刚度、承重等生物力学特性以及骨架的完整性，并具有低免疫原性和良好的生物相容性。I型胶原还是组成胶原纤维的主要成分，当I型胶原蛋白分泌到胞外基质中后，其C-前肽与N-前肽被蛋白酶剪切去除，形成成熟的胶原蛋白，其能自我组装成高度有序的结构，即胶原纤维[23]。

3.2 Ⅱ型胶原蛋白

目前从畜禽类骨骼提取的Ⅱ型胶原蛋白多来源于畜禽的胸部及关节软骨，是畜禽类软骨基质的主要构成成分之一。Ⅱ型胶原蛋白既具有促进软骨细胞分化的功能，还可通过口服Ⅱ型胶原蛋白诱导自身免疫耐受，抑制关节炎[24～26]。Ⅱ型胶原蛋白的主链不含α-螺旋，主要为β-折叠和无规则卷曲结构；甘氨酸残基的含量是羟脯氨酸的4～5倍，占氨基酸总数的30%左右，且不含有色氨酸，而不同物种、不同来源的Ⅱ型胶原蛋白具有独特的DNA及mRNA序列，其氨基酸的组成和比例以及物化性质上均存在差异[27]。Ⅱ型胶原蛋白的三螺旋结构极易被破坏，其依靠如氢键、范德华力、水合作用及二硫键等分子间和分子内各种作用的协同效应共同维持稳定，而分子间作用力则通过疏水作用和离子作用提供。因此，Ⅱ型胶原蛋白的三螺旋结构的热稳定性会受到如氨基酸的组成和序列、蛋白质来源以及翻译后修饰等因素的影响；外界环境亦会对其热稳定性造成一定影响，主要有pH值、离子浓度、溶剂、温度等，如温度超过34℃将极易使其变性[28～31]；但不同生长环境的生物源Ⅱ型胶原蛋白的变性温度有一定差异，推测生物的生活环境可能影响Ⅱ型胶原蛋白的理化性质[32]。

4 畜禽类骨胶原蛋白肽的功能性

4.1 骨质改善

胶原蛋白是骨骼的重要组成部分。而体内雌激素急剧变化、年龄增加、高脂膳食等因素会造成人体骨代谢失衡，骨胶原加速降解，降低骨质量，最终表现为骨的净丢失，导致骨质疏松症[33]。研究表明胶原蛋白及胶原肽能够改善骨质，并对骨质疏松症具有很好的预防及缓解治疗作用。刘俊丽[34](2013)等研究发现0.3mg/mL的牛骨胶原蛋白能显著促进人成骨细胞的增殖，是一种有效防治骨质疏松的营养补充剂。Lin[35](2018)等研究表明，从鸡胸骨软骨中提取的肽可以提高骨细胞存活率，提高线粒体膜电位，降低骨细胞凋亡率，抵抗cd-诱发的骨质疏松症，作为预防骨质疏松症的功能性食品具有一定的应用潜力。

此外，有不少研究通过去卵巢大鼠模型研究胶原肽的骨质改善功能，发现服用畜禽骨胶原肽大鼠的骨密度、骨微结构和骨代谢水平均有一定改善，抑制骨矿物质和骨有机质的丢失，说明畜禽骨胶原蛋白肽能够有效改善去卵巢大鼠骨质疏松症状[36～40]。目前关于畜禽类骨胶原蛋白肽骨质改善的相关研究仍停留在实验室阶段，临床实验报道较少，还需研究者进一步探究。

4.2 抗氧化

机体内的多种抗氧化酶与抗氧化剂能够清除自由基，维持机体的氧化还原平衡。过剩的自由基引起的氧化应激不仅参与机体衰老等生理过程，也与糖尿病、心血管疾病等相关[41～43];但机体清除自由基的能力会随着年龄的增加及不良环境因素刺激而逐渐下降，因此近年来人们对抗氧化剂的需求以及质量要求日渐增高。目前的抗氧化剂主要是通过化学合成制备，但其对人体具有一定毒副作用，人们更倾向于选择安全高效的天然抗氧化活性物质。对此，人们十分关注抗氧化剂的开发与利用，近年来从天然植物资源以及海洋资源中挖掘了大量的抗氧化活性成分，广阔的畜禽类资源亦是发现新型抗氧化物质的研究方向。近年来的研究表明，畜禽骨胶原蛋白及其肽普遍具有抗氧化活性，可以有效清除自由基，抑制不饱和脂肪酸和生物大分子的氧化；其活性与其氨基酸组成、结构、疏水性、分子量等都有关，胶原蛋白肽的螯合和清除自由基能力与其氨基酸组成中的甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)等氨基酸的含量有关[44]。以DPPH、羟自由基、超氧阴离子与ABTS自由基清除率等作为检测指标，可有效判断骨胶原肽的抗氧化活性强度。Ku[45](2014)等发现牛骨胶原蛋白肽DPPH自由基清除率高达72.81%，超氧阴离子自由基清除活性高达(11.88±0.59)SODU/g，具有较强抗氧化能力；而采用不同的蛋白酶进行酶解会影响胶原蛋白肽的抗氧化性[46]。同时亦有研究发现，畜禽骨源胶原蛋白肽如鸡骨肽的抗氧化活性比植物源胶原蛋白肽如大豆肽更为明显[47]。这类天然、毒性低的抗氧化肽能有效清除人体的自由基，一般作为添加剂使用，提高食品、药品和保健品等产品的价值，延长产品的货架期。

4.3 抗高血压和血管紧张素(ACE)抑制活性

血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme, ACE)能够催化无活性的血管紧张素I转化为有强血管收缩活性的血管紧张素Ⅱ，引起血管收缩，导致血压升高，是高血压的主要发病原理。因此血管紧张素转化酶(ACE)是临床治疗高血压的靶点之一[48]，ACE酶抑制剂对高血压、心力衰竭等疾病有显著的治疗作用。目前临床上使用的ACE特异性抑制降压药属于化学合成类ACE抑制剂，具有一定副作用，会使人体产生不良反应；研究表明，利用酶解、化学水解或微生物发酵手段能够从肉源物料中提取包括ACE-I，肾素和DPP-IV抑制剂在内的安全有效的生物活性肽[49]，并且不会产生副作用。有研究发现，骨胶原肽如鸡骨肽对ACE可产生可逆抑制中的竞争性抑制，其可通过与ACE结合，从而减少ACE酶催化ACE-I转化为ACE-Ⅱ，由此起到降压作用[47]；Zhang[50](2013)等研究表明，在适当的前处理和酶处理条件下，猪骨等富含胶原的食品材料是有效的ACE抑制肽释放的良好底物；Lafarga[51](2014)等以牛骨胶原蛋白为原料，通过模拟预测及验证后，发现脯氨酸含量丰富的胶原蛋白具备较高的ACE抑制活性，是ACE抑制肽的良好制备来源，并说明牛骨胶原蛋白肽具有降低血压的作用。此外，畜禽骨源性ACE抑制活性肽虽然在疗效上弱于化学合成类降压药物，但因其可长期服用而无副作用产生，具备较佳的安全性，在医药领域具有十分广阔的应用前景。

4.4 皮肤改善

人体皮肤内胶原蛋白的合成量会随着年龄增长而减少，引起结构与功能衰退，导致皮肤变薄以及皱纹增多，因此胶原蛋白减少被认为是皮肤衰老的特征之一[52]。此外，紫外线辐射等环境因素也会损伤胶原蛋白，加速皮肤衰老过程[53]。

畜禽骨胶原及其肽具有大量亲水性氨基酸残基，可以添加在营养美容产品中作为生物活性成分[54]，改善皮肤的构造和屏障功能，通过促进胶原蛋白和透明质酸的合成以及成纤维细胞生长和迁移，增加皮肤的持水量与弹性以及修复紫外线UV对皮肤的伤害；因其含有丰富的酪氨酸残基，可与酪氨酸竞争，抑制酪氨酸酶的活性，减少黑色素的形成，具有美白效果。邵茜[55](2017)等发现牛骨胶原肽能显著提高光老化皮肤成纤维细胞的增殖活性，提高细胞内抗氧化酶系的活力；目前对于畜禽骨源胶原蛋白肽改善皮肤活性功能的深入研究报道较少，大多集中于鱼源胶原蛋白肽，在后续研究中可尝试进一步探究畜禽骨源胶原蛋白肽对皮肤的改善作用，开拓畜禽骨胶原蛋白肽在美容及医疗行业的市场。

4.5 免疫调节

人体的免疫系统由免疫器官、免疫细胞、细胞因子以及免疫相关信号等共同组成。畜禽骨胶原蛋白肽增强人体免疫力的功能受到了学术界和工业界的广泛关注，在食品开发及医药研发领域具有广阔的前景[56]。一些研究表明畜禽骨胶原蛋白肽具有免疫调节功能。张慧琴[57](2021)等发现羊骨胶原肽可通过Toll样受体信号通路对炎症反应发挥双向调节作用，剂量为10～104μg/mL时可增强巨噬细胞的免疫能力，105μg/mL时可诱导巨噬细胞释放大量炎性介质，引起炎症反应。而对脂多糖诱导的炎症反应，羊骨胶原肽亦具有一定的抗炎效果。

研究发现畜禽骨胶原肽可通过诱导免疫耐受对类风湿性关节炎等自身免疫性疾病起到一定的预防及治疗作用。由于Ⅱ型胶原蛋白是类风湿性关节炎最主要的自身抗原之一[58，59]，以一定浓度的畜禽骨源Ⅱ型胶原蛋白诱导人体免疫耐受，可有效改善及预防类风湿性关节炎症状。Lugo[60](2016)等发现未变性的鸡Ⅱ型胶原蛋白可明显改善膝关节炎患者症状，且耐受性良好；刘安军[26](2014)等发现口服猪软骨源Ⅱ型胶原蛋白具有一定的抗类风湿性关节炎效果，但胶原肽不具备抗关节炎作用，推测可能由于Ⅱ型胶原蛋白进一步水解后三螺旋结构被破坏，Ⅱ型胶原蛋白与胶原肽的结构差异使胶原肽不具有免疫调节功能。

4.6 其他作用

从现今的研究不难看出，畜禽类骨胶原蛋白肽中新的生物活性仍在不断被发掘。张顺亮[61](2013)等利用中性蛋白酶酶解牛骨胶原蛋白，超滤分离后得到分子质量小于10kD，且具有较好抑菌活性的胶原肽，在20mg/mL的浓度下对大肠杆菌抑菌率为93.61%；研究发现骨胶原蛋白肽能够明显减少火鸡制品中的菌落数，说明骨胶原蛋白肽具有抑菌作用，可延长产品货架期[62]。冀霞[63](2021)等发现羊骨胶原肽钙螯合物可抑制去卵巢大鼠的氧化应激水平，可能通过JAK/STAT通路改善肾组织病变。缪福俊[64](2011)等发现驴骨蛋白多肽能增加小鼠体内肝糖原含量，降低血乳酸含量，明显延长小鼠的负重游泳时间，且小鼠体重无明显增长，具有抗疲劳的作用。畜禽骨胶原蛋白及其肽还参与调节人体诸多生理功能，如神经、消化、吸收和代谢等，但其中有些作用机理仍有待明确。

5 畜禽类骨胶原蛋白肽的应用

由于畜禽骨胶原蛋白肽拥有多种生物活性，并且多肽可以通过胃肠道直接吸收，与胶原蛋白相比更利于人体消化吸收，因此被广泛用于食品领域，用于改善各种因缺乏胶原蛋白而引起的亚健康状态；畜禽骨胶原蛋白肽的抗氧化活性及抑菌活性使其可作为抗氧化剂和抗菌防腐剂用于食品工业中。

畜禽骨胶原蛋白肽一般作为补充剂添加到保健品及美容产品中，提升产品的营养特性与质感。畜禽骨胶原蛋白肽可作为补钙功能食品的添加剂，提高人体对钙的吸收率和生物利用度，通过在儿童保健品或饮品中添加牛骨胶原蛋白肽，能够稳固地把钙沉积在儿童的骨组织内，有效预防和改善骨质疏松，提高骨骼韧性，防止钙流失，提高钙吸收率[65]；畜禽骨胶原肽产品不仅能够全面提升人体免疫力，保持皮肤弹性和预防皱纹，而且有利于皮肤的修复，改善皮肤质量[66]；此外，畜禽骨胶原蛋白肽较好的乳化性及稳定性，使得其可作为乳化剂、增稠剂应用于饮料及其他食品等。

在医药方面，畜禽骨胶原蛋白肽可通过促进胶原蛋白的合成有助于骨骼和关节疾病的治疗，增强骨密度，预防骨质疏松和关节炎，促进软骨再生；其较好的生物相容性与低抗原性使其作为载体应用于药物递送系统。口服或经鼻给药畜禽骨源Ⅱ型胶原蛋白，诱导人体免疫耐受，可明显改善患者的关节炎症状[67]。

6 结论与展望

在畜禽类加工产业快速发展的同时，对其生产加工过程中产生的大量富含胶原蛋白废弃骨头的综合利用，无疑具有重大的经济价值与社会意义。随着畜禽类制品在国内消费市场的需求日渐上升和居民保健意识的增强，畜禽类骨头的再利用愈发重要，用畜禽骨来制备胶原蛋白及其肽能够有效提高畜禽骨的利用率。

近年来，随着畜禽骨胶原蛋白肽酶解与分离纯化技术日益成熟，且具有良好的溶解度、吸收性及保湿性等物理特性与诸多生物活性，其在食品、保健品、美容产品及生物医药等领域中的应用愈加广泛。作为一类具有安全性和多种生理活性的生物源制品，畜禽骨胶原蛋白肽的市场化备受关注，但还存在如提取方法不够高效、储存稳定性不足以及临床实验不足等问题与挑战。由于畜禽骨物料坚硬且含有较多矿物质，选择高效安全且环保的提取工艺是制备优质骨胶原肽产品的关键。骨胶原蛋白肽的稳定性对于其生理活性影响极大，因此储存方法亦至关重要[68，69]。同时，骨胶原肽的构效关系、生物利用率及其作用机制需要进一步阐明，将有助于畜禽骨高值化利用和畜禽骨胶原蛋白肽的产业化升级，为其更广泛的应用提供理论依据。