肉类发酵菌种真空冷冻干燥保护剂研究进展

毕雨星 张香美 卢 涵 赵晶晶 魏兴芳 卢音音

河北经贸大学生物科学与工程学院 河北石家庄 050061

发酵肉制品是以畜禽肉为原料，自然或人工控制腌制的一类肉制品，传统发酵肉制品为自然发酵，品质受气候、人为操作影响较大，存在的差异性也较大[1]。随着发酵剂在生产上的普及，人工接种发酵已经成为传统发酵肉制品实现工业化的一种普遍做法。目前对制备直投式发酵剂的研究较多，方法多为喷雾干燥和真空冷冻干燥(简称冻干)，后者以其所具有的适用范围广、发酵粉剂活菌成活率高等优点成为使用较多的工艺之一，但其过程不可避免会对菌体细胞造成损伤，为此，应用合适的冷冻干燥保护剂至关重要。基于此，本文主要综述了冻干保护剂及其在直投式肉用发酵剂制备过程中的应用。

1 肉类发酵剂概述

发酵剂是指含有活的或休眠的微生物，能在发酵基质中进行理想新陈代谢活动的制剂[2]，在肉制品发酵过程中，对提高肉制品的营养、安全、品质及风味起着关键性作用[3～5]。常用的肉类发酵剂主要有以下2类：(1)乳酸菌。主要包括乳杆菌属、链球菌属、片球菌属等。其作用主要是促进pH值的快速下降，抑制有害微生物产生的不良反应，维持产品稳定性并延长货架期[6，7]。(2)凝固酶阴性球菌。主要包括木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌等，它们在发酵肉制品生产中主要是通过硝酸盐还原作用来保障肉制品的色泽品质，并且其代谢活动对风味的形成起着重要作用[8]。人工接种发酵剂所具有的显著优势，使得当前研究热点集中在其功能性上，广大研究者为优良发酵剂的筛选做了大量的研究工作。Slima[9](2017)等通过研究植物乳杆菌TN8对牛肉香肠质量和安全性的影响时发现：植物乳杆菌TN8的加入能改善香肠的质地和色泽，并且可以控制脂质氧化和肠道沙门氏菌及单核细胞增生李斯特氏菌的生长，可以作为一种潜在的益生菌发酵剂。张香美[10](2018)等筛选的植物乳杆菌b-2具有较好的抑菌能力和抗氧化能力，张香美[11],卢涵(2018)模仿葡萄球菌BP10能起到增强产品香味的作用，混合2种发酵剂生产发酵香肠，可提高发酵香肠质量。

虽然发酵剂得到了广泛使用，但是在运输以及储存过程中如何保持较高活菌数和活力的问题日益凸显。近年来，直投式发酵剂以其具有的显著优势而成为发酵技术研究的热点之一[12]。该类发酵剂发酵活力强，不需要进行重新传代就可以直接投入生产应用，在使用和管理上都更为方便[13]。

2 直投式肉用发酵剂

现今微生物发酵研究及其在各行各业的应用越来越多，为保证生产效果的稳定，应用冷冻干燥技术制备发酵菌粉成为当前研究热点之一[14]。为确保产品的生产稳定性，提高产品质量，直投式发酵剂在肉制品生产方面的应用日渐增多。直投式肉用发酵剂是指不必进行活化等过程，直接投入肉制品生产的一类发酵剂，能够解决普通发酵剂使用时具有的一系列问题，简化生产工艺与传代复壮次数。

早在2004年，双汇公司就开发出直投式肉制品发酵剂，研究发现，该发酵剂不仅发酵性能优良，且冻干后能够保持较高的活菌数，能达到1010cfu/g，保存时间也较长，这打破了我国一直以来对发酵剂进口的依赖局面，并且使发酵剂生产趋于专业化、规范化和统一化[15]。近年来，研究者对肉用直投式发酵剂也做出了大量研究。孔保华[16](2015)等制备了发酵肉制品直投式发酵剂并用于生产发酵肉，研究表明，制得的肉制品具有较为理想的感官评价，且能够缩短发酵周期，应用效果良好，产品品质得到了提升。王卫[17](2019)等将直投式发酵剂应用于四川传统风羊腿的加工制作中，通过实验测定发现微生物发酵剂显然有利于游离氨基酸的降解和风味物的形成。母雨[18](2019)等制备植物乳杆菌-木糖葡萄球菌直投式复合发酵剂并用于火腿发酵，经实验测定表明它们能改善发酵火腿的风味品质。

虽然直投式发酵剂生产发酵肉能够总体上提升肉制品的品质，缩短发酵时间，但是菌粉冻干存活率低的问题一度成为阻碍肉类发酵行业发展的壁垒。冻干存活率是衡量菌粉发酵活力的关键指标，是体现直投式发酵剂制备工艺优劣的重要因素。王琳[19](2012)等以干酪乳杆菌为研究对象，进行冷冻干燥后细胞存活率低至5.25%；黄燕燕[20](2018)等在制备植物乳杆菌DMDL9010直投式发酵剂时，冻干存活率仅达到13.38%，这都表明制备工艺需要进一步优化，以此来提高冻干存活率，从而制备出更加优良的直投式发酵剂。

3 真空冷冻干燥技术对细胞损伤机理

真空冷冻干燥是一种除去含水物料中水分的干燥方法，是用来干燥热敏性物质和保存物质生物活性的一种有效方法，现已成为保存菌体细胞最方便、最成功的方法。近年来该技术广泛应用于食品、生物、医药等领域，具有广泛的应用前景。

真空冷冻干燥主要分成两步进行。首先是样品预冻，即将样品处于低温下冷冻，之后是通过真空环境将样品中的水分升华、解吸，从而达到去除水分的目的。经过低温和真空环境处理，产品不易氧化、热变性，能最大程度上保持产品生物活性[21]。但冻干过程会造成菌体细胞死亡，研究表明，细菌的存活率和发酵活力下降的主要原因如下：(1)冷冻和干燥会造成细胞膜通透性增加，主要与冷冻过程中冰晶的形成和干燥过程中的磷脂双分子层损伤有关；(2)细胞膜流动性下降，磷脂分子从液晶态向凝胶态转变的过程会使得磷脂分子流动性下降，从而对细胞膜流动性造成损伤；(3)细胞酶及相关蛋白变性，溶质的浓缩效应及细胞脱水效应会导致细胞酶失活，破坏蛋白质与水分子、细胞膜之间的相互作用力，引起蛋白质构象发生改变，丧失生物功能；(4)核糖核酸结构发生变化，冷冻干燥过程会引起蛋白质变性，使DNA双螺旋结构的稳定性下降，造成细菌生物活性下降[22～24]。

鉴于直投式肉用发酵剂具备的一系列优势以及冷冻干燥过程对菌体细胞的损伤机制，加入冻干保护剂成为当前保持菌粉活力的重要方法。保护剂种类、含量的选择，以及保护剂复配优化成为当前热点研究方向。并且菌株不同，使用的保护剂配方也不尽相同，这给后续冻干保护剂的研究带来了挑战。

4 冷冻干燥保护剂

4.1 保护剂种类

冷冻干燥过程中，加入保护剂能对细胞提供保护作用，降低细胞损伤[25]。常见保护剂种类如表1所示。

表1 常见保护剂

4.2 保护剂复配

由表1可以看出，不同类型的保护剂作用机制不同，存在较大差异，且多数情况下，单一保护剂保护机理较单一，无法达到最大程度上的保护效果，所以在冷冻干燥过程中需要选择不同保护类型的保护剂进行复配，通过交叉保护达到最佳保护效果。

近年来，对于冻干保护剂的配方优化研究越来越多，目前使用较多的保护剂为脱脂乳粉、海藻糖、甘油、蔗糖、乳糖、谷氨酸钠等。张菊[27](2020)等通过单因素试验研究低聚木糖对乳酸菌的冻干保护效果时发现，5%的低聚木糖的添加仅能使乳酸菌冻干存活率达到63.7%，之后通过添加脱脂乳粉、海藻糖和甘油，将糖类、蛋白质类、醇类保护剂进行复配，使各类保护剂优势互补，发挥最佳保护效果，最终可使冻干存活率提升到80%左右。周佳豪[30](2020)等得出了同样的结果，对干酪乳杆菌LZ183E冻干保护剂进行复配优化后，结果显示海藻糖、低聚木糖、脱脂乳粉和谷氨酸钠的复合添加可使菌株存活率高达(98.236±0.137)%，显著高于单因素试验单一保护剂添加时的冻干存活率。张风华[28](2019)等在制备嗜酸乳杆菌直投式发酵剂时，使用保护剂配方：海藻糖3.03g/100mL、甘油9.50g/100mL、谷氨酸钠3.50g/100mL，该制备工艺可使得冻干存活率达到81.24%。较高的冻干存活率表明菌粉发酵活力较好，保护剂复配效果优良。

综上所述，单一保护剂虽能对菌体冻干过程起到一定的保护作用，但是通过多种类保护剂的融合添加，逐步提高菌粉冻干存活率，能够使保护作用发挥出最佳效果，最大程度上起到保护菌体细胞免受冻干损伤的作用。

5 展望

随着发酵肉制品的广受青睐，人工接种的普及，与其相关的研究已经成为当前发酵肉行业的研究热点。为得到稳定、便携生产且产品质量佳的发酵肉制品，广大研究者目前多采用真空冷冻干燥技术将发酵菌种制成直投式发酵剂，使生产效益最大化。但冷冻干燥造成菌粉冻干存活率低的问题苛待解决，冻干保护剂的研究为解决该问题提供了新的研究思路。单一保护剂的添加并不能使保护效果最大化，对保护剂复配研究成为提高菌粉冻干存活率的研究热点。菌株不同会使得最佳保护剂配方、冷冻干燥工艺存在较大差异，故而对保护剂的复配研究需要进一步探索。