水稻土细菌群落对长期施肥和短期氮添加的响应*

曹彦强，张中峰，徐广平，滕秋梅，蒋先军

(1.西南大学资源环境学院，重庆 400715；2.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西喀斯特植物保育与恢复生态学重点实验室，广西桂林 541006)

0 引言

细菌作为微生物的重要组成部分，其在有机质分解、腐殖质形成等诸多土壤生态过程中发挥着重要作用。目前，细菌的生态特性已逐渐成为评价土壤质量的重要指标，可用于指示土壤的肥力形成及其演变过程[1]。水稻土是我国重要的耕作土壤之一，也是耕地土壤中最为高产稳产的类型，约占全国耕地面积的1/5。但是，水稻土的形成状态深受人为活动的影响[2]。例如，尽管化肥施入土壤带来了作物的增产，但是会造成土壤板结、酸化和生物性状下降等生态环境问题[3，4]。土壤细菌对环境条件具有较高敏感性，其结构和功能的改变能够有效指示化肥施用下土壤环境或植被的变化。因此，近年来通过长期定位试验来探究施肥对土壤细菌影响的研究受到人们的广泛关注。陆海飞等[5]研究表明，与不施肥对照相比，有机/无机肥配施下土壤细菌的香农指数和丰富度指数显著增大；邢亚薇等[6]通过实时荧光定量PCR (Real-time PCR)技术发现黄土旱塬农田单施化肥处理的细菌数量较不施肥裸地增加21%，pH、全氮和有机碳含量是影响土壤微生物群落丰度的重要因子；刘佳等[7]以祁阳红壤实验站的冬小麦-夏玉米定位试验为研究对象，结果表明长期不同施肥方式改变了旱地红壤优势菌的相对丰度，长期施肥后旱地红壤细菌群落主要受土壤pH的影响。

由于独特的水分管理措施，水稻土细菌群落组成与其他耕作土壤的相比表现出诸多差异，但目前关于长期施肥下水稻土细菌群落变化的研究相对较少[8]。本研究依托1989年西南大学建立的中性紫色水稻土长期定位试验站，针对不施肥(CK)和施用化肥(CF)两种不同处理下的水稻土，通过MiSeq高通量测序，研究30年长期施肥对水稻土壤细菌的影响规律。由于氮素是植物生长和发育所必需的养分元素，氮肥是最主要的化肥施用类型[9]，因此本研究特意设置为期56 d的室内氮添加试验，探究短期高强度氮添加对水稻土细菌群落的影响，以便深入了解长期施肥对水稻土细菌多样性、群落结构和组成的影响。

1 材料与方法

1.1 样品采集

土壤样品采集地点位于国家紫色土长期定位试验基地(106°26′E，30°26′N)，长期定位试验始于1989年。于2019采集不施肥、施用化肥两种水稻土样品(分别用CK、CF表示)，其中年施肥量为尿素273.1 kg·hm-2，过磷酸钙500.3 kg·hm-2，氯化钾150.1 kg·hm-2。土壤样品装入无菌袋中运回实验室，筛出碎石等杂物后在4℃冰箱暂存，用于后续分析测定以及室内氮添加试验。

1.2 短期氮添加试验

采用室内培养的方法，根据土壤含水量称取过2 mm筛的鲜土(以10.00 g干重计)置于150 mL的玻璃广口瓶。对不施肥水稻土和施肥水稻土每周分别添加氮浓度为50 mg·kg-1的CO(NH2)2。通过均匀添加无菌水调节土壤水分含量至田间持水量(WHC)的60%，并在培养过程中每隔7 d以称重法补充蒸发损失的水分以保持土样的水分含量恒定。将广口瓶置于28℃恒温培养箱中培养56 d。培养结束后取样，并与原始土壤样品一起进行高通量测序。使用CK+N和CF+N分别表示两种水稻土加氮培养56 d后的土壤样品。

1.3 土壤基本性质分析

1.4 土壤DNA的提取、高通量测序

本试验所采用的DNA提取试剂盒为Fast DNA®SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals)，并使用微量紫外分光光度计(NanoDrop ND-1000 UV-Vis)测定DNA浓度。使用引物F515 (5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和R907(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)对细菌16S rRNA基因的V4-V5区域基因进行扩增；PCR反应程序为98℃预变性1 min，98℃变性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环。应用Illumina MiSeq平台进行高通量测序，并委托上海美吉生物科技有限公司完成。测序原始序列上传至NCBI的SRA (Sequence Read Archive)数据库，登录号为SRP259259。

1.5 数据处理与统计分析

利用Excel 2010、SPSS 13、R software (Version 3.1.1)对数据进行处理与统计分析，使用Origin 8.5软件作图，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan法进行差异显著性检验(ɑ=0.05)，用Spearman法进行相关分析。利用Mothur软件(version 1.31.2)分析α多样性指数(Chao1和Shannon指数)。基于Bray-Curtis距离矩阵的主坐标分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)计算不同处理下土壤细菌组成的差异性(β多样性)。使用冗余分析(Redundancy Analysis,RDA)阐明影响土壤细菌群落的关键环境因子。

2 结果与分析

2.1 不同处理下土壤化学性质

表1 不同土壤理化性质Table 1 Physicochemical properties of different soil

2.2 土壤细菌多样性

水稻土样品高通量测序共获得313 581条优质序列，以97%相似性阈值进行Operational Taxonomic Unit (OUT)聚类，在CK、CF、CK+N和CF+N处理中分别得到1 349，1 624，1 301，1 524个OUT (表2)。Chao1指数通常用来描述群落丰富度，CF处理下的Chao1指数显著高于CK处理(P<0.05)。短期氮添加后Chao1指数与未加氮土样相比并未产生显著差异。对于Shannon指数，呈现出与Chao1指数类似的变化，CF处理相较于CK处理显著提高了水稻土壤细菌群落多样性(P<0.05)。

表2 细菌群落α多样性指数表(97%序列相似性)Table 2 Alpha diversity index table of bacterial community (97% sequence similarity)

不同处理间水稻土细菌群落组成差异的PCoA分析结果如图1所示。在OTU水平上，PCoA1与PCoA2分别解释变量方差为43.16%和11.42%，累计解释度达54.58%，PCoA1可将CK和CK+N的细菌群落与CF、CF+N明显区分开。56 d氮添加后的土壤样品与原始土样相比分离距离较小，未明显分开，短期施氮对微生物群落结构产生的影响较小。

图1 不同处理土壤细菌群落主坐标分析(PCoA)Fig.1 Principal co-ordinate analysis (PCoA) of soil bacterial community under different treatments

2.3 土壤细菌群落物种组成

如图2所示，在门水平上统计各样本物种丰度，水稻土中的优势菌门(>1%)包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门(Planctomycetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。在CK处理中，上述优势菌门的平均相对丰度分别为27.26%、19.04%、17.01%、14.42%、6.06%、5.69%、3.09%、1.93%和1.25%。在CF处理中，Proteobacteria、Planctomycetes和Bacteroidetes的平均相对丰度显著高于CK处理(P<0.05)；而Actinobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadetes和Firmicutes呈现出相反的情况。在所有样品中，Proteobacteria、Acti-nobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi的总占比均超过70%，其中Proteobacteria的相对丰度均为最高。比较CK和CK+N可知，56 d的室内氮添加明显提高了不施肥水稻土中Proteobacteria和Bacteroidetes的相对丰度(P<0.05)；对比CF和CF+N，短期氮添加显著提升了施肥水稻土中Nitrospirae的相对丰度(P<0.05)。

不同小写字母代表处理间差异显著(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P<0.05)图2 土壤细菌优势种群相对丰度Fig.2 Relative abundances of the dominant bacterial species in soil

2.4 土壤细菌群落与环境因子的相关性

表3 土壤环境因子与细菌多样性指数、优势菌门相对丰度之间的相关性系数Table 3 Correlation coefficient between soil environmental factors and bacterial diversity indices and relative abundance of dominant phyla

图3 土壤细菌群落组成与环境变量的RDA分析Fig.3 Redundancy analysis (RDA) of soil bacterial community composition and environmental variables

3 讨论

在本研究中，水稻土细菌群落的α多样性(Chao1指数和Shannon指数)在施肥处理下有所提高，而有研究报道称长期施肥导致土壤微生物多样性降低[18，19]，这种差异可能源于施肥时间跨度的不同。另外，土壤细菌多样性对肥料施用的响应并不一致，它们会随着施肥方式、轮作、土壤类型、土地利用方式和其他因素的变化而有所不同[20，21]。一项调查45年稻田试验中细菌群落演变的研究表明，长期施肥并未对水稻土微生物结构产生显著影响[22]。细菌多样性由pH主导，化肥施用导致的土壤酸化使得细菌多样性降低[23]。相较于其他研究，本研究中pH值的波动较小，且营养物质水平明显提高；Chao1指数和Shannon指数在氮添加前后并未产生显著变化(表2)，表明短期氮添加对于土壤细菌α多样性影响较小。

pH是决定土壤微生物群落结构的关键生态因子[7]，而土壤养分作为微生物生存发展的必要营养元素，在土壤中的有效性也成为影响或制约土壤微生物群落结构的重要因子[26]。本研究中，pH、AP、AK等环境因子对细菌群落结构与组成产生重要影响，这与大多数研究结果吻合[23,27]。

4 结论

综上所述，长期施肥处理能够影响水稻土壤pH、养分、土壤细菌多样性、群落组成和结构；短期氮添加对土壤细菌多样性特征影响较小。Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi在此次试验水稻土中的占比超过70%。土壤pH和营养状况(例如AP、AK、TP和TN等)是影响重庆地区水稻土细菌群落形成的主要驱动因子。在未来工作中，探究不同施肥处理间土壤微生物群落结构的差异及其原因，可为保持土壤微生物多样性及农业可持续发展等提供重要的理论和实践依据。