栽培年限对走马胎生长及有效成分含量的影响*

唐凤鸾，颜小捷，梁英艺，孙菲菲，赵 健**

(1.广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所，广西桂林 541006；2.中共罗定市龙湾镇委员会，广东罗定 527235；3.桂林医学院药学院，广西桂林 541001)

0 引言

走马胎(ArdisiagigantifoliaStapf.)是紫金牛科紫金牛属多年生常绿灌木，具有祛风壮骨、活血化淤、消肿止痛、止血生肌等功效。走马胎干燥根系常用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、产后血瘀、腹痛、痈疽疮疡[1-3]，叶片是西南地区药浴的必备材料，可祛湿提神。从走马胎根系中提取的三萜皂苷类、岩白菜素衍生物、挥发油等化合物[4-6]具有良好的抗炎、抗肿瘤和抗氧化作用[7,8]。市场上走马胎多为野生资源，但随着用量的迅速增加，资源破坏严重，已濒临灭绝[9-11]。为满足市场需求，走马胎的人工栽培面积不断扩大，但由于技术缺乏导致效果不佳。

生物量是产量形成的物质基础，在一定时期内生物量随生长年限延长而快速增加，成年后随着生长力的下降生物量趋于稳定[12]，但各器官生物量的变化存在物种、植株年龄及生长环境等差异[13-15]。多年生木本药用植物有效成分一般都随着植株生长年限的增长而增加，或达到一定程度后停止增加转为下降[16]。例如:巴戟天水晶兰苷含量随着生长年限的增长而增加[17]，中国肉桂反式肉桂醛含量呈现先增加后降低的变化趋势[18]。因此，掌握植株年龄对药用植物各器官生物量和有效成分的影响是高效栽培的关键技术之一。

现有研究主要集中于走马胎的资源调查[9-11]、化合物和有效成分[5,19]、药理和病理[7,8]、组织培养[20-22]等领域。有关走马胎的栽培研究并不多见，且主要借助盆栽进行研究。如周泽建等[23]研究上层树种对走马胎的化感作用；魏蓉[24]研究环境因子对走马胎生物量和皂苷含量的影响。上述研究虽然对走马胎栽培有一定的参考作用，但均未涉及栽培年限对走马胎生物量和有效成分积累的系统研究。因此，本文以1-5年生走马胎种子直播植株为对象，研究不同栽培年限对其根、茎、叶生长发育及有效成分含量的影响，探讨走马胎各器官生物量及有效成分积累的动态变化规律，为走马胎药材质量控制和科学采收提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验区域概况

试验区位于广西壮族自治区桂林市恭城瑶族自治县平安乡，110°93′54″E，24°88′64″N，海拔330 m；年均气温19.7℃，年均降雨量1 437 mm，年平均相对湿度80%。样地缓坡20°，上层树种为杉木，郁闭度75%-85%;土壤类型为黑色砂质土，土壤背景值见表1。

表1 试验区土壤检测结果Table 1 Test results of soil in the test area

1.2 试验材料及生物量统计

2020年10月，选择生长良好、无病虫危害的1-5年生走马胎种子直播植株，每个栽培年限随机取样10株，重复3次。卷尺测量株高，游标卡尺测量基茎粗(离地面5 cm高的茎粗)，并统计叶片数量。采用全株挖掘的方法挖取植株，并根据走马胎植株特点将其分为根、茎、叶3部分，做好标签。装入封口袋带回实验室，清洗干净表面杂质后晾干水分，105℃杀青30 min后70℃烘干至恒质量，测量干质量。

1.3 有效成分检测

1.3.1 供试品溶液制备

分别将烘至恒质量的样品磨碎，过40目筛，精密称取0.10 g，加50%甲醇10 mL超声提取1 h，13 000 r·min-1离心5 min,上清液分别定容至10 mL，摇匀备用。

1.3.2 总皂苷含量测定

1.3.2.1 标准曲线制作

精密称取齐墩果酸5.10 mg置10 mL 容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.51 mg·mL-1的对照品溶液。分别精密吸取0，50，100，150，200 μL对照品溶液于试管中，60℃鼓风吹干，加入5%香兰素0.2 mL，高氯酸0.8 mL，保鲜膜封口,摇匀后置于60℃水浴15 min，自来水冷却，迅速加入冰醋酸5 mL，保鲜膜封口摇匀，静置5 min，以0 μL对照品溶液管作为空白对照，590 nm 波长下测定吸光度。以齐墩果酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，得齐墩果酸含量测定标准曲线和回归方程。

1.3.2.2 样品中总皂苷含量测定

分别吸取供试品溶液0.1 mL注入试管，按照1.3.2.1节步骤测定样品的吸光度，依据求得的回归方程计算样品总皂苷含量。

1.3.3 总酚含量测定

1.3.3.1 标准曲线制作

精密称取没食子酸10.4 mg置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1.04 mg·mL-1的对照品储备液。精密吸取1 mL对照品储备液置于10 mL 容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.104 mg·mL-1的对照品溶液。分别精密吸取0，40，80，120，160，200，240，400 μL对照品溶液于试管中，加入Folin试剂0.5 mL，混匀后静置2 min，加入7.5%碳酸钠溶液1.5 mL，加去离子水稀释至5 mL，振荡混匀，暗置30 min，以去离子水管作为空白对照，760 nm波长下测定吸光度。以没食子酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，得没食子酸含量测定标准曲线和回归方程。

1.3.3.2 样品中总酚含量测定

分别吸取供试品溶液0.1 mL注入试管，按照1.3.3.1节步骤测定样品的吸光度，并依据求得的回归方程计算样品总酚含量。

1.3.4 总黄酮含量测定

1.3.4.1 标准曲线制作

精密称取芦丁4.216 mg，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.421 6 mg·mL-1的对照品溶液。分别精密吸取0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 mL对照品溶液于试管中，加去离子水稀释至5 mL，加入5%的亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀后静置6 min，加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀后静置6 min，加入4%氢氧化钠溶液4 mL，摇匀后静置30 min，以0 mL对照品溶液管作为空白对照， 495 nm波长下测定吸光度。以芦丁含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，得芦丁含量测定标准曲线，并得到回归方程。

1.3.4.2 样品中总黄酮含量测定

分别吸取供试品溶液1 mL，注入试管，按照1.3.4.1节步骤测定样品的吸光度，并依据求得的回归方程计算样品总黄酮含量。

1.4 结果计算

总生物量=根生物量+茎生物量+叶生物量，

根比重=根生物量/总生物量，

茎比重=茎生物量/总生物量，

叶比重=叶生物量/总生物量，

地上生物量比重=(茎生物量+叶生物量)/总生物量。

1.5 数据分析

采用 Excel 2010软件进行数据处理，并利用 SPSS 16.0 软件进行单因素差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 栽培年限对走马胎植株生长的影响

由图1可知，栽培年限对走马胎植株高度、基茎粗及叶片数量均有显著影响。株高和基茎粗随栽培年限的延长显著增加(P<0.05)，且增长节奏和变化趋势非常相似，均为第2，3年处于趋势线下方，第4，5年位于趋势线上方，说明株高和基茎在第2，3年的增长速度较第4，5年低。走马胎叶片数量由大到小依次为5年、4年、2年、1年、3年，其中第5年(14.11张)显著高于1-4年(5.4-8.22张)(P<0.05)，第4年显著高于1，3年(P<0.05)，1-3年变化不明显。

不同字母表示差异显著(P<0.05)Different letters indicate significant differences (P<0.05)图1 栽培年限对走马胎植株形态指标的影响Fig.1 Effect of planting years on the morphological indexes of A.gigantifolia Stapf.

2.2 栽培年限对走马胎各器官生物量的影响

表2结果显示，1-5年生走马胎植株根、茎、叶生物量随栽培年限延长显著增加(P<0.05)，且增量由大到小依次为根、茎、叶。根、茎生物量增长速度最快出现在第4年，分别较前一年增加794%和719%，第5年最慢，仅为126%和154%；叶第2年最快，比第1年增加338%，之后均保持在130%左右。

表2 不同栽培年限对走马胎各器官生物量的影响Table 2 Effects of different planting years on the biomass of each organ of A.gigantifolia Stapf.

2.3 栽培年限对走马胎各器官物质分配规律的影响

由表3可知，栽培年限可显著影响走马胎各器官生物量分配比(P<0.05)，但不同器官比重变化规律差异较大。根比重、地上部比重随栽培年限延长变化无规律；茎、叶比重变化趋势基本相反，茎比重随栽培年限延长逐渐增加，叶比重随栽培年限延长逐渐减小。根生物量占比较茎、叶高，占比0.30-0.51，最大值出现在第4年；茎、叶比重分别为0.15-0.41、0.11-0.46。

表3 不同栽培年限对走马胎各器官生物量分配的影响Table 3 Effects of different planting years on biomass allocation of different organs of A.gigantifolia Stapf.

2.4 栽培年限对走马胎各器官活性物质含量的影响

由图2可知，走马胎各器官中活性物质含量总体呈现根>叶>茎，且受栽培年限的影响较大。3年生走马胎植株根、茎、叶的总皂苷含量最高，分别为3.14%、1.9%和1.52%；1年生茎、叶的总酚、总黄酮含量最高，分别为1.81%、2.96%和2.34%、3.11%;4年生根的总黄酮含量最高,为7.54%;其次为2年生根的总酚含量,为4.01%。

不同字母表示差异显著(P<0.05)Different letters indicate significant differences (P<0.05)图2 不同栽培年限对走马胎不同器官有效成分含量的影响Fig.2 Effects of different planting years on the content of effective components in different organs of A.gigantifolia Stapf.

3 讨论

随着栽培年限的延长，走马胎株高、基茎粗，及根、茎、叶生物量均呈现显著增加的变化趋势，且根、茎生物量增长速度最快出现在第4年，说明栽培年限是影响走马胎各器官生物量的重要因素。走马胎地上部分生物量比重较大值出现在第2，3年，地下部分出现在第4，5年；茎生物量比重随年限延长显著增加，叶生物量则为减少。这与多年生植物随着生长的进行会分配更多的生物量到地上部分[25]，及白刺植株随着生长的进行会将更多的生物量分配给同化吸收器官而不是支持结构的研究结果[26]存在较大差异。究其原因，可能与所研究物种的生物学特性有关：走马胎植株因无侧枝生长而限制了茎、叶的增长空间，从而导致生长后期地上部分及同化器官叶片生物量比重的下降，同时根系生物量比重增加。

走马胎不同器官中有效成分含量差异较大，总体呈现为根>叶>茎，这与传统用药习惯相符，说明走马胎根系为其主要药用部位具有科学依据。同时，栽培年限能明显影响走马胎不同器官的有效成分含量，但变化趋势因成分类型不同存在明显差异，这是因为不同成分的生物合成代谢途径差异及代谢途径中调控关键基因的表达差异所致[27，28]。其中，抗肿瘤主要活性成分皂苷含量最高出现在第3年，且根、茎含量显著高于其他年限，这与3年生柴胡、三七(Panaxnotoginseng)根中皂苷含量最高的结果[29-31]一致。但此结果在以皂苷类物质为主要成分的药用植物中是否具有普遍性还需要进一步研究。

4 结论

综合走马胎植株生长发育和生物量积累规律，及有效成分含量变化特点，可见走马胎最佳药用部位为根系，栽培3-4年采收比较合适。本研究结果可为走马胎药材使用和采收提供科学依据，具有较好的使用价值。