复合植物精油抑制饲料霉菌的效果研究

◆作者：周鹏 唐胜球 潘宇杰 董小英

◆单位：韶关学院英东生物与农业学院

霉菌是真菌的一部分，在自然环境中分布广泛，且种类繁多，最常见的霉菌有曲霉、青霉、镰刀菌、麦角菌属等。其中，霉菌中产生毒素最甚者为黄曲霉，黄曲霉能够分泌黄曲霉毒素（AFT）B1、B2、G1、G2 等18 种，而黄曲霉中产毒素B1 是已经被判定为毒性最强的物质之一，其毒性比氰化钾大10 倍，比砒霜大68倍。1993 年，世界卫生组织的癌症研究机构划定黄曲霉毒素为已知毒性极强的致癌化学物质之一（李书国等，2009）。另有数据显示，全世界平均每年因霉变而损失的粮食大约是其总产量的10%（刘国信，1999）。因此，预防霉菌带来的危害，针对抑制霉菌生长的研究是十分必要的。

植物精油是由植物的叶、枝、根茎等原材料，经过蒸馏等方法萃取出的具有芳香性气味的物质。植物精油作为一种天然的活性物质，具有很强的杀菌抑菌、抗氧化以及增强机体免疫力等生物学功能（邬本成等，2013）。国内外研究表明，天然植物精油对常见的真菌如黄曲霉菌具有显著的生长抑制作用，且部分精油对一些黄曲霉毒素有一定程度的降解作用（王萍等，2021）。现有资料显示，丁香、小茴香、大蒜、香菜、山苍子和八角等植物都具有较强的抑菌作用，且具有诸多的药理作用。如丁香和小茴香可抑制致病性真菌及葡萄球菌、痢疾和大肠杆菌等。山苍子含有柠檬醛等活性成分，易与黄曲霉毒素等有害物质发生分解、氧化等化学反应，是消除黄曲霉毒素最有效、最安全的物质（曲春阳，2012；管志远等，2005；李春美等，2004）。佟晶晶等（2018）证实，多种精油复合的效果比单一精油对特定细菌的抑制效果更强。此外，研究表明，天然植物精油作为防霉剂对动物饲养无毒害作用（Pereira 等，2014）。由此可见，植物作为饲料防霉剂具有一定研究意义，而复合植物配方精油更有可能具有好的防霉效果。因此，本实验对部分天然植物精油的防霉作用进行研究，利用联合抑菌效果评价方法，在所选植物精油筛选出对霉菌具有最佳抑菌效果的单方或复方精油的最佳配方。

2 材料和方法

2.1 实验材料

植物：山苍子、丁香、小茴香、大蒜、香菜和八角。

霉菌：在实验室从发霉玉米粉中提取并分离培养。

饲料：玉米粉。

土豆培养基：取新鲜马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL。先将马铃薯洗净，去皮后切成0.5 cm3的小块煮沸15~20 min，然后用四层纱布过滤（佟晶晶等，2018），加入葡萄糖、琼脂和蒸馏水至1000 mL，高温灭菌20 min，留存备用。

察氏培养基：实验室自配（硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂15 g）。

2.2 实验方法

2.2.1 玉米粉中霉菌的分离培养

取适量玉米粉于培养皿中，放入温度为40℃，湿度90%的培养箱中让其霉变。待玉米粉霉变后，用接种环刮取适量霉菌放入培养皿中，置于28℃培养箱中，培养两天。

2.2.2 霉菌悬液的制备

用接种环挑取3-4 环（每个菌落扣一下）于10 mL 无菌管的无菌水中，采用显微镜直接计数法测出总菌数（血细胞计数板计数），然后制成106~107CFU/mL均匀霉菌悬液。

2.2.3 霉菌抑制试验

参照滤纸片法（王加启等，2003）。无菌条件下，将霉菌菌悬液0.1 mL 滴入察氏培养基，涂布均匀即含菌平板。将1 片直径6mm的无菌滤纸片贴于含菌平板的皿内中央，并使之展开。向滤纸片滴加精油，精油添加体积相等（20μL）。以添加无菌水的滤纸片为空白对照，培养皿用保鲜膜密封。细菌于37℃条件下恒温培养20 h，霉菌于28℃条件下恒温培养4-5 d。培养结束，用十字交叉法测量各抑菌圈直径，结果取平均值。每组重复3 次。

参照抑菌圈试验判定标准：抑菌圈直径>18 mm 为高度敏感，10mm~18mm 为中度敏感，5mm~10 mm 为低度敏感。

2.2.4 最低抑菌浓度试验

参照最低抑菌浓度MIC 试验（胡俊，2001），将菌悬液0.1 mL滴入培养基中，涂布均匀即含菌平板。精油用0.22μm 的微孔过滤器过滤，并用tween-80 稀释。吸取各稀释液1 mL 于无菌条件下加入含菌平板的皿盖中央，倒置培养，使培养皿内空气中的精油浓度分别达到1~180 mg/L 空气系列浓度（使细菌培养皿内空气中精油浓度分别达到0.18000、0.09000、0.04500、0.02250、0.01125 mg/mL），以不生长菌的样品的最低浓度为精油对该菌的气相MIC，每个试验重复3 次。

3 结果与分析

3.1 不同植物来源精油对饲料霉菌的抑制效果

通过查阅大量的参考文献与资料，选出了对霉菌有较好抑制作用的6 种植物，并对其蒸馏出山苍子精油、丁香精油、小茴香精油、大蒜精油、香菜精油和八角精油。通过抑制圈直径测定方法，筛选出具有较强抑制饲料霉菌活力的精油，抑制霉菌结果见表1。由表1 可知，精油对饲料霉菌的抑制效果为：山苍子> 丁香> 小茴香> 大蒜> 香菜。丁香、山苍子和小茴香精油属于高度敏感的范畴，山苍子精油在该实验中能有效抑制霉菌生长，属三种精油中最敏感的；丁香与小茴香精油对霉菌有较强的抑制作用，它们的抑制圈十分明显，抑制圈呈椭圆形，轮廓线表现不规则状。其它精油虽然也对饲料霉菌有一定的抑制作用，但是相比之下不太明显。

表1 6 种植物精油对饲料霉菌的抑制效果

3.2 复方精油对饲料霉菌的抑制作用

由3.1 测定结果可知，山苍子精油是最具有抑制霉菌的单方精油，其次是小茴香精油和丁香精油，为了更深入地了解它们联合效果，将山苍子精油和其它两种精油等体积复合，分别测定它们对霉菌的抑菌圈直径，其结果如表2。结果显示，山苍子、山苍子+ 小茴香（1∶1）和山苍子+丁香+ 小茴香（1∶1∶1）组的抑菌圈均大于90 mm。因此，山苍子单方精油及山苍子+ 小茴香和山苍子+ 丁香+ 小茴香的复合精油均有较好的抑制饲料霉菌效果。

表2 复方植物精油对饲料霉菌的抑制效果

为了科学评价山苍子精油、小茴香精油和丁香精油单方精油及其复合精油对霉菌的抑制效果，分别进行了最低抑菌浓度（MIC） 的测定和联合抑菌评价（FIC）实验。由表2 可知，小茴香+ 山苍子精油（1∶1 混合）的MIC 比复合小茴香+ 山苍子和丁香精油（1∶1∶1 混合）低，说明复合小茴香+ 山苍子精油的抑菌效果比复合小茴香+ 山苍子+ 丁香精油的抑菌效果好。此外，复合小茴香+ 山苍子精油的FIC 为0.926<1，说明复合精油中的小茴香精油和山苍子精油的抑菌效果是相加作用。而复合小茴香+ 山苍子+ 丁香中的1

3.3 不同比例复合小茴香和山苍子精油对饲料霉菌的抑制作用

由以上试验结果可知，在多种复合精油中，小茴香精油和山苍子精油复合的抑菌效果最佳。但不同的精油配比对抑菌效果则不同，因此，为了更进一步确定最佳复合精油配比，对小茴香精油和山苍子精油以（7∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3、1∶5、1∶7）比例混合，每组三个平行实验，用无菌水作为对照，进行了10天抑菌效果的实验，得出实验结果见表3。由表3 可知，各种不同配比浓度的复合小茴香+ 山苍子精油对饲料霉菌均有抑制作用，且以1∶1、1∶3、1∶5、1∶7（小茴香精油：山苍子精油）混合精油的抑菌能力相对较好，而1∶5（小茴香精油：山苍子精油）的MIC 值最低。因此，最好的复合精油混合比例是小茴香精油：山苍子精油=1∶5。

表3 复合小茴香和山苍子对饲料霉菌的抑制作用

4 讨论

饲料在加工、储存和运输过程中容易发生霉变，霉变后产生的霉菌毒素不仅污染饲料、降低营养价值，还会引起畜禽产生一系列的健康问题，如中毒、腹泻、生长和繁殖障碍等症状，严重影响动物的生产（Rocha 等，2014）。王晓佳的调查研究证实，75%～100%的饲料样本含有一种以上的霉菌毒素，在低剂量的情况下就可能影响动物健康。大多数霉菌能够同时产生多种霉菌毒素，饲料可能同时被几种霉菌毒素污染，进而引起畜牧产品质量下降和饲料工业的混乱，甚至可能导致高污染作物的拒收和处理（王晓佳，2021）。由于植物精油具有无毒、较强的抑菌性和环境友好等优点，本文主要对山苍子、丁香、小茴香、大蒜、香菜和八角植物精油的抑菌特性进行了研究，并证实其对饲料霉菌具有一定的抑制效果。

抑菌圈的大小反映了精油对霉菌的抑制效果，抑菌圈直径越大，精油抑制霉菌效果越好。最低抑制浓度是能抑制培养基内霉菌生长的最低精油浓度，是测量抗菌药物的抗菌活性大小的一个指标；而联合抑菌评价是通过评价复合精油的各种成分相互作用的效果。植物精油在抑制霉菌生长及毒素产生方面效果理想，是潜在饲料防霉剂（梁丹丹等，2015；尚继峰等，2007；王利 敏 等，2018； 代 安 娜 等，2021）。中国农业科学院农产品加工研究所质量与安全研究室比较了山苍子油、丁香酚、肉桂醛、柠檬醛、桉叶油、茴香油、樟脑油和薄荷油等8 种植物精油对黄曲霉、镰刀菌、赭曲霉等生长和产毒的抑制效果，发现肉桂醛和丁香酚可有效抑制黄曲霉的生长及产毒。另有研究证实，黄曲霉、灰绿曲霉及青霉对丁香精油属于高度敏感（梁丹丹等，2015）。此外复合植物精油防霉剂（肉桂醛∶柠檬醛∶丁香酚∶薄荷醇=3∶3∶2∶2，v/v/v/v）应用在玉米储藏上，可有效抑制黄曲霉生长（尚继峰等，2007）。采用滤纸片法测定丁香、八角、薄荷、花椒、大蒜、橙皮及复合精油对从玉米中分离得到的黄曲霉、黑曲霉、产黄青霉、青霉菌和杂色曲霉的抑制作用，证实丁香∶八角∶薄荷∶花椒=1∶1∶1∶1复合精油对上述霉菌均有抑制作用，对青霉菌的抑制作用最为显著。且复合精油均高于霉菌对相同剂量的单种精油的敏感度（王利敏等，2018）。由于精油经过一定体积比的复合后可以起到协同增效的作用，而得到比单种精油更好地抑菌效果（代安娜等，2021）。本研究通过抑菌圈、最低抑制浓度的测定，联合抑菌评价，在6 种植物精油中筛选出对霉菌有较好抑制作用的山苍子植物精油。并发现复合精油的抑菌效果比单方精油的抑菌效果好，小茴香精油和山苍子精油以1:5 比例混合时对饲料霉菌具有最佳抑制效果。因此，该复合精油可用作天然饲料防霉剂。