尿液中膀胱癌生物标志物的研究进展

董陶涛，陈林，刘迅，王凯，何江枢，陈书练，杨进，罗旭

(1.遵义医科大学，贵州 遵义 563000； 2.成都大学附属医院泌尿外科，成都 610081)

近几十年来，膀胱癌的发病率和死亡率急剧上升[1]。80%的膀胱癌患者为非肌肉浸润性膀胱癌，其余患者表现为肌肉浸润性膀胱癌[2]。膀胱癌患者尽管接受了根治性治疗，但仍有高达50%的非肌肉浸润性膀胱癌患者最终复发，其中30%的患者进展为肌肉浸润性膀胱癌[2]。由于膀胱癌复发率高，建议根据疾病的初始分级和分期间隔进行监视膀胱镜检查。在病情严重的情况下，3个月内避免膀胱镜的使用[3]。尿液细胞学是一种非侵入性的检测和监测尿路上皮性膀胱癌的方法。细胞学检查的特异性较高，但敏感性低限制了其在常见低级别膀胱尿路上皮性癌中的应用[3]。

目前，美国食品药品管理局批准了6种与膀胱镜检查相结合用于临床尿液分析的方法：核基质蛋白(nuclear matrix protein，NMP)22酶联免疫吸附试验、NMP22 BladderChek和UroVysion已获得批准进行膀胱癌的诊断和监测；免疫细胞(UCyt+)、膀胱肿瘤抗原(bladder tumor antigen，BTA)-TRAK和BTA-STAT已被批准仅用于原发性肿瘤诊断后的膀胱监测。在膀胱癌中，以尿液为基础的诊断试验为提高膀胱癌的检出率提供了一种无创方法。非侵入性检测膀胱癌的方法不仅对患者的损伤更小，而且成本更低[4]。此外，尿液生物标志物可能用非侵入性的方式评估潜在新治疗靶点的效果[5-6]。现就膀胱癌尿液生物标志物的研究进展进行综述，进一步讨论以尿液为重点的膀胱癌生物标志物与疾病复发和进展的关系。

1 蛋白质生物标志物

1.1NMP22 NMP22是一种从凋亡细胞中释放出来的核有丝分裂蛋白，参与DNA重组和复制[7]。美国食品药品管理局已批准使用NMP22进行膀胱癌的早期诊断，并评估膀胱癌复发的风险。一篇包含71项研究、22 260名参与者的Meta分析阐述了NMP22的灵敏度和特异度，结果显示NMP22的灵敏度(68%，95%CI62%～74%)高于尿脱落细胞学(44%，95%CI38%～51%)，但特异度(79%，95%CI74%～84%)低于尿脱落细胞学(96%，95%CI94%～98%)[8]。为了提高特异性，临床医师必须明确可能导致假阳性的原因，加强NMP22检测临床应用的可行性。研究表明，尿液NMP22水平与肿瘤分期和分级密切相关[9]。NMP22仍是目前研究最充分的生物标志物之一。但有Meta分析认为，NMP22单独使用时灵敏度较低[8]。NMP22检测可以测量各种条件下可能进入尿液的细胞数，包括膀胱肿瘤的表面脱落。肿瘤恶性程度越高，敏感性越高，适用于高级别膀胱癌的早期诊断，可以减少膀胱镜检查次数，减少医疗费用，提高患者生活质量。

1.2BTA BTA是由膀胱癌细胞产生的人补体因子H相关蛋白，干扰补体激活并使肿瘤细胞逃避免疫监视[10]。美国和欧洲进行的多中心研究发现，BTA检测在诊断膀胱癌方面明显较尿液细胞学更敏感[11]。有研究表明，BTA诊断膀胱癌的总体灵敏度和特异度分别为57%～83%和60%～92%[12-13]。在良性膀胱疾病患者中，如肾结石、感染和血尿等，BTA检测报告的特异性需严格评估，血尿中含有补体因子H，可与BTA相关抗体发生反应，导致假阳性结果。先前的研究分别比较了尿液细胞学和BTA检测的敏感性、特异性，与NMP22检测一样，一些良性泌尿生殖系统疾病可能会导致假阳性结果[14]。因此，BTA在临床上尚不能取代膀胱镜检查。在排除泌尿系良性疾病的情况下，随着肿瘤分期和分级的增加，BTA检测的灵敏度也随之升高，然而，与其他非细胞检测一样，特异性低于细胞学检测。

1.3可溶性Fas Fas作为肿瘤坏死因子受体家族的成员之一，参与免疫稳态和免疫监视，激发抑制凋亡信号通路，从而促进炎症和癌症的发生[15]。据报道，多种恶性肿瘤(如膀胱尿路上皮癌、宫颈癌)患者尿液中可溶性Fas水平均升高，与晚期和高级别患者相比，早期和低级别患者的可溶性Fas水平较高[16]。常规酶联免疫吸附试验分析表明，尿液中可溶性Fas水平是膀胱癌复发和肿瘤进展至浸润期的预测因子。虽然膀胱癌患者检测尿液可溶性Fas与NMP22的总体表现差异无统计学意义，但灵敏度>75%时可溶性Fas的特异性始终高于NMP22[17]。由于尿液中可溶性Fas的特异性低，可能影响临床诊断，样本采集方案和分析需要进一步标准化。

1.4生存素(survivin) survivin是一种小分子蛋白质，属于凋亡抑制蛋白家族，在肿瘤细胞中大量表达，与预后相关。这种凋亡抑制蛋白在促进癌细胞存活和抑制细胞死亡方面均有作用[18]。survivin信使RNA在胚胎和胎儿发育过程中选择性表达，在正常成人组织中检测不到或低表达，但在癌症患者中高表达。尿液中survivin基因的蛋白和信使RNA水平均被证明与膀胱癌的发生、较高的肿瘤分级和晚期病理阶段有关，但与肿瘤侵袭性无关[19]。目前已有多种技术和检测方法用来检测survivin的信使RNA和蛋白水平，但最常见的方法是斑点杂交(Biodot test，Fujirebio Diagnostics[Malvern，PA])[19]。一项涉及2 051例膀胱癌患者的Meta分析显示，尿液中survivin诊断膀胱癌的灵敏度为77%，特异度为92%；与免疫组织化学和信使RNA检测相比，survivin-酶联免疫吸附试验对高级别肿瘤更敏感[20]。

2 基因组生物标志物

2.1端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT) 端粒酶是一种RNA依赖的DNA聚合酶，它介导端粒的复制以维持细胞增殖，在大多数非肿瘤组织中随着细胞分裂次数的增加，端粒会不断缩短，细胞分裂和增殖受到限制，导致细胞凋亡。相反，端粒延长被认为是恶性肿瘤发生发展的标志之一[21]。其催化成分TERT是控制端粒酶活性的决定因素。研究发现，TERT核心启动子区域(C228T和C250T)的突变与人类恶性肿瘤的发生相关，84%的尿路上皮膀胱癌有TERT启动子突变[22-23]。TERT启动子的突变已被确认为膀胱癌复发最常见的基因改变，与患者的预后及复发关系密切[24]。从膀胱癌患者的尿液中提取的sDNA和cfDNA均检测到TERT突变。利用实时荧光定量聚合酶链反应检测膀胱癌患者TERT活性，灵敏度为75%～96%，特异度为69%～96%[25]。但有研究报道，TERT的假阳性率较高[22]，作为膀胱癌标志物仍需要进一步完善。

2.2成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3) FGFR3属于酪氨酸激酶家族，负责成纤维细胞生长因子信号通路转导，在细胞的增殖和分化中起调节作用[26]。有研究报道，FGFR3突变后与肿瘤的形成存在因果关系，FGFR3基因的激活突变是非肌层浸润性膀胱癌患者最常见的突变基因之一，60%～80%的非肌肉侵袭性尿路上皮性膀胱癌患者有FGFR3突变[27]。有研究发现，尿液中FGFR3诊断膀胱癌的灵敏度为39%[27]。FGFR3突变在低级别尿路上皮膀胱癌中更常见，并且与较短的复发时间显著相关[28]。研究发现原发肿瘤中有70%的FGFR3发生突变的同时会出现肿瘤复发，证明使用非肌肉浸润性膀胱癌热点突变进行纵向监测是合理的[28]。在肌肉浸润性膀胱癌中，不同分期的膀胱癌差异较大。因此，肌肉浸润性膀胱癌标志物的临床应用需要更多纵向研究来解决其异质性问题。

3 表观遗传与转录组生物标志物

3.1DNA甲基化 DNA甲基化是最具特征的表观遗传现象。在基底细胞癌和癌前病变中发现了DNA的高甲基化和低甲基化区域。DNA甲基化状态通常发生在癌变过程的早期，癌症相关基因的沉默影响癌症表观遗传变化的发生发展[29]。在无细胞DNA片段和尿液中脱落的肿瘤细胞中可以检测DNA甲基化状态。高甲基化是尿路上皮膀胱癌的一个共同特征[30]。尿液中的cfDNA片段和肿瘤细胞可以评估DNA甲基化状态。与良性患者相比，膀胱癌患者甲基化基因(如结肠腺瘤样息肉蛋白和细胞周期蛋白D2)的甲基化显著升高[31]。在尿路上皮癌患者中已发现谷胱甘肽S-转移酶P1、结肠腺瘤样息肉蛋白和视黄酸受体β2基因的高甲基化[32]。有研究表明，对特定位点的1 370个DNA甲基化进行分析可以区分非浸润性和肌肉浸润性尿路上皮癌。近年来，通过对尿路上皮性膀胱癌患者尿沉渣中性别决定区Y框蛋白1、L1MET(long interspersed nuclear element-1 methylation)和白细胞介素-1受体相关激酶3基因甲基化状态的检测，发现DNA甲基化对膀胱癌复发的预测价值高于尿液细胞学和膀胱镜检查[30]。DNA尿液生物标志物有较高的特异性，但这些标志物检测的条件更为苛刻。由于不同实验室和不同研究小组对尿甲基化DNA诊断准的准确性不同，其临床应用需要进一步的技术改进和大规模的研究验证。

3.2微RNA(microRNA，miRNA) miRNA是一种短链的(21～23个核苷酸)非编码RNA，通过与信使RNA的3′非翻译区配对来调节基因表达。一些miRNA在肿瘤的发生、发展和转移过程中起重要作用[33]。肿瘤组织中miRNA表达具有高度稳定性和组织特异性。尿液的上清液或尿沉渣中均含有miRNA，所以尿液是miRNA的较好来源[34]。由于miRNA长度较短，miRNA较RNA链更不易降解，可以在室温下储存长达48 h。miRNA可以在体液中作为自由循环的miRNA被发现，或者与核糖核蛋白结合形成复合物。胞外囊泡的外泌体中也发现部分miRNA。但研究的方法与操作过程不统一，尿液中miRNA的诊断价值仍存在争议。研究发现，在膀胱癌患者尿液的上清液中发现，miR-99a和miR-125b表达下调；与非肿瘤对照组相比，膀胱癌患者尿液中miR-126水平更高；高级别膀胱癌患者尿液中的miR-146a-5p明显升，同时miR-200C的低表达与非浸润性尿路上皮癌的肿瘤进展有关[35]。在肌层浸润性膀胱癌患者尿液中的miR-618和miR-1255b-5p水平明显高于对照组[36]。

3.3长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA) lncRNA是长度超过200个核苷酸的非编码RNA，存在于血浆、血清和尿液等生物液中，参与调控基因表达或某些表观遗传征象。lncRNA的异常调控参与多种疾病的发生发展[37-38]。有研究显示，lncRNA水平异常在促进肿瘤发生发展中起重要作用[39]。据报道，膀胱尿路上皮癌细胞系的侵袭、迁移和增殖与结肠癌相关转录因子1有关，这可能为临床预后评估提供一种有效的分级、分期工具。尿沉渣中循环尿路上皮癌抗原1水平可作为膀胱癌的潜在诊断指标，通过依赖磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B途径参与膀胱癌的进展。尿路上皮癌相关蛋白1是一种长非编码RNA，诊断膀胱癌的灵敏度和特异度分别为81%和92%[40]。高水平的uc004cox.4 lncRNA可能会降低非浸润性尿路上皮癌的发生率[41]。随着测序技术的普及，癌症中更多表达有差异的lncRNAs将会被发现。

3.4信使RNA 循环信使RNA可在一定程度上反映细胞的状态，虽然大多数循环中的信使RNA被RNA酶降解，但在癌症患者中仍然可以检测到循环信使RNA[42]。因此，信使RNA被认为是尿液中潜在的生物标志物。膀胱癌患者尿液泛素结合酶E2C和含异亮氨酸谷氨酰胺基序的GTAase激活蛋白的基因水平高于对照组[43]。有研究显示膀胱癌患者尿液中含有IQ基序的GTP酶激活蛋白3信使RNA表达水平明显高于对照组，进一步探索发现，IQ基序的GTP酶激活蛋白3对膀胱癌的侵袭性和病理分级也有较高的诊断准确率，表明IQ基序的GTP酶激活蛋白3可以在肉眼血尿或镜下血尿的情况下区分膀胱癌和非膀胱癌患者[44]。此外，尿液中碳酸酐酶9剪接变异体信使RNA可提高尿路上皮性膀胱癌的诊断价值，灵敏度为90%，特异度为72%[45]。总之，信使RNA已显示出作为恶性肿瘤生物标志物的应用前景，但仍需进一步研究。

4 代谢组生物标志物

外泌体是大部分体液中含有的膜小泡，恶性肿瘤患者的表达水平高于健康人群[46]。外泌体通过转移不同的生物活性分子(RNA、DNA和蛋白质)参与细胞间的通讯，从而可能影响某些药物参与的生理反应。外泌体可用于膀胱癌的早期诊断和监测，通过观察尿路上皮膀胱癌患者尿液中外泌体的含量，可以估计患者尿液中存在特定的蛋白质和miRNAs[47]。通过使用microarray平台和实时荧光定量聚合酶链反应分析miR-375和miR146a能在一定程度上区分尿路上皮膀胱癌是否为高级别肿瘤[48]。此外，蛋白质组学分析显示，膀胱癌患者尿液中存在肿瘤相关钙信号转导蛋白2，外泌体还可以通过传递EGF样蛋白重复序列和盘状蛋白1样结构域促进膀胱癌的进展[49]。膀胱癌患者体内miR-126/miR-152比值增大与膀胱癌的发生有关[50]。体内代谢生物标志物的表达水平与年龄呈正相关，这为检测膀胱癌的发生发展提供了一种新思路[51]。

5 新兴尿液生物标志物

尿液生物标志物的研究旨在提高尿路上皮性膀胱癌诊断的敏感性、特异性和准确性。膀胱特异性核基质蛋白-1和特异性核基质蛋白-4是针对尿路上皮性膀胱癌组织的NMP，不受感染、吸烟、导尿术或膀胱炎等因素的干扰[48]。在血尿患者中，aurora A激酶可以区分非肿瘤性血尿和低级别尿路上皮性膀胱癌[52]。烟酰胺N-甲基转移酶在尿路上皮性膀胱癌中高表达，与病理分级有关[53]。无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶氧化还原因子-1在尿路上皮性膀胱癌中呈高表达，与肿瘤分级和分期有关，在复发性膀胱癌中也呈高表达[54]。活化的白细胞黏附分子水平与膀胱癌患者的分期和总生存率呈正相关[5]。细胞角蛋白20实时荧光定量聚合酶链反应诊断尿路上皮性膀胱癌的灵敏度为78%～87%，特异度为56%～80%，提高了肿瘤进展诊断的准确性，但对低级别肿瘤的诊断效能较差[6]。尿液中高水平的细胞角蛋白8和细胞角蛋白18可以通过快速检测尿路上皮性膀胱癌来区分高级别和低级别肿瘤[55]。肝细胞生长因子激活因子1和抗上皮细胞黏附分子是高危非肌肉浸润性膀胱癌患者的预后标志[56]。Snail过表达是非侵袭性尿路上皮性膀胱癌复发的独立预后因素[57]。此外，尿糖蛋白作为特定的糖蛋白，可以在低级别和高级别的非浸润性尿路上皮癌中检测到，其中高级别肌肉浸润性膀胱癌患者的尿液CD44升高[58]。一项基于尿蛋白检测FGFR3/细胞周期蛋白D3的研究显示，其诊断膀胱癌的灵敏度和特异度分别为73%和90%[59]。尿液中含有吲哚丙烯酰甘氨酸、N2-半乳糖醛酸基-赖氨酸和天冬氨酸的代谢产物可以在高级别的膀胱癌中被检测出来。此外，超高效液相色谱串联质谱证实非侵袭性尿路上皮性膀胱癌苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸和色氨酸的代谢途径发生了改变[60]。

6 小 结

膀胱癌尿液生物标志物领域发展迅速，但目前还没有生物标志物能够替代膀胱镜检查和尿液细胞学检查。同样，在多中心临床研究中，近年发现的蛋白质组、基因组、表观基因组、转录组和代谢组学作为尿液生物标志物的大量数据需要进一步验证。多靶点生物标志物的使用正逐渐增加，而且这些生物标志物的联合使用具有更高的诊断效能。尽管尿液生物标志物的领域不断扩大，但有限的验证研究，以及不同组学之间复杂的相互作用，是生物标志物开发和验证的重要挑战。未来的高通量数据和复杂的人工智能与新的数学模型的使用可能给膀胱癌的诊断与监测带来巨大帮助。