微RNA-22对骨肉瘤形成及治疗影响的研究进展

任伟，郭世炳，徐翔，王亚超，刘晓强，赵伟，王紫横，王玉鑫

(1.内蒙古医科大学，呼和浩特 010059； 2.内蒙古医科大学第二附属医院 a.骨肿瘤科，b.微创脊柱外科，呼和浩特 010030)

骨肉瘤是目前临床最常见的原发性恶性骨肿瘤，约占恶性骨肿瘤的60%[1-2]。儿童及青少年的骨肉瘤发病率较高，常见于血运丰富的干骺端，如肱骨近端、股骨远端和胫骨近端[3]。早期骨肉瘤的远处血行转移率较高，约80%的骨肉瘤患者术后最终发展为远处转移[4]。肺转移是骨肉瘤患者死亡的主要原因[5]，骨肉瘤患者的5年生存率仅为50%～60%，晚期或多药耐药患者的5年生存率更低[6]。目前临床多采用手术联合新辅助化疗治疗骨肉瘤，患者5年生存率提高至60%～70%[7-8]。随着肿瘤广泛切除、辅助化疗和放疗等治疗策略的应用，骨肉瘤治疗取得一定的进展，但骨肉瘤患者的预后仍很差[9-10]。化疗药物的耐药性、肿瘤转移及复发等仍是影响骨肉瘤患者预后的重要因素[11]。

微RNA(microRNA，miRNA/miR)是一类非编码RNA分子，可转录并调控基因的表达，成熟miRNA是单链RNA分子，长度22～25个核苷酸，在骨肉瘤的发生发展、侵袭、转移等方面发挥了重要的作用。大多数miRNA的序列高度保守，许多物种的相当一部分miRNA具有物种特异性[12]，miRNA的转录在细胞核内完成，初级转录产物分解成前体分子，前体分子借助输出蛋白5从细胞核进入细胞质[13-14]。在细胞质中，动物和大多数植物的miRNA通过与靶信使RNA的3′非翻译区域配对并抑制靶基因对蛋白质的翻译而发挥其调节作用，导致信使RNA降解或翻译抑制[15-17]。miR-22作为miRNA家族中的重要成员，其表达不仅可抑制骨肉瘤的发生发展、阻止其侵袭扩散，并可改善骨肉瘤患者对化疗的耐药反应[18]。现就miR-22在骨肉瘤中的发生发展、侵袭转移及其在骨肉瘤治疗中的应用等予以综述。

1 miR-22的产生及作用

miR-22是一个进化上保守的基因，位于染色体17p13上，Lagos-Quintana等[19]在2001年首次在HeLa细胞中克隆了人miR-22基因，并提出人miR-22基因转录为22 nt的非编码RNA片段。目前有关miR-22的研究较多，miR-22参与了许多生物学过程，如心脏重构、细胞周期调控、增殖、分化和凋亡[20]，而miR-22解除调控也是人类恶性肿瘤的前兆[21]。研究表明，miR-22的高表达与恶性肿瘤患者的良好预后密切相关，如上皮性卵巢癌[22]、肝细胞癌[23]和乳腺癌[24]等。

miR-22既是癌基因又是抑癌基因，其具体作用在很大程度上依赖于其相应靶基因。若miR-22的靶基因参与恶性肿瘤抑制过程，则miR-22可能通过结合3′非翻译区降解靶基因或抑制翻译，起到癌基因的作用[25]。Ren等[26]研究发现，癌组织环状RNA-ITCH(circRNA-ITCH，circ-ITCH)通过调节骨肉瘤中miR-22的表达发挥骨肿瘤抑制作用，过表达circ-ITCH可降低miR-22的表达，并促进骨肉瘤细胞的凋亡，抑制骨肉瘤细胞的存活、增殖、迁移和侵袭；反之，上调miR-22可减弱circ-ITCH对骨肉瘤细胞存活、增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。进一步研究表明，circ-ITCH通过抑制人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和SP-1(一种转录因子)，下调骨肉瘤细胞中miR-22的表达，从而促进骨肉瘤细胞的凋亡。

miR-22是抑癌基因，其表达与恶性肿瘤患者临床病理特征相关。Xiang等[27]研究发现，miR-22的高表达与TNM分期、淋巴结转移、远处转移、复发呈负相关。肿瘤患者miR-22表达水平越高，发生淋巴结转移、远处转移和复发的可能性越低。miR-22高表达预示肿瘤的预后良好，反之预后不良，可能出现侵袭转移。

2 miR-22与骨肉瘤

2.1miR-22与骨肉瘤的发生发展 miR-22参与调节多种生物活动和病理过程，包括恶性肿瘤的形成和发展。目前关于miR-22与骨肉瘤的发生、发展机制的研究相对较少。miR-22在多种恶性肿瘤细胞中异常表达，如肺癌、胃癌、乳腺癌和结肠癌细胞中miR-22表达水平较低，前列腺癌和白血病中miR-22表达水平较高[28]。研究证实，骨肉瘤细胞中miR-22呈低表达，其可能作为抑癌基因抑制骨肉瘤细胞的生长[29]。miR-22可抑制骨肉瘤细胞MG-63的发生和增殖。Gai等[30]利用定量实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测miR-22的水平发现，骨肉瘤细胞MG-63中miR-22的表达水平明显低于成骨细胞；通过miR-22模拟物感染MG-63建立其过表达模型，以未感染细胞为空白组，空载体感染细胞为阴性对照组，用四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞存活率，结果显示，感染miR-22模拟物的MG-63的增殖能力明显低于空白和阴性对照(空载体)组；且miR-22过表达显著提高了MG-63的凋亡率；使用流式细胞仪检测MG-63的细胞周期和凋亡，结果表明，miR-22过表达可使Bcl-2相关X蛋白(促进凋亡蛋白)水平升高、Bcl-2(抑制凋亡蛋白)水平降低，miR-22模拟组G0/G1期MG-63细胞百分率明显高于空白组和阴性对照组，故认为miR-22通过促进MG-63细胞G0/G1期阻滞抑制MG-63细胞增殖，并诱导其凋亡。Diao等[31]研究发现，miR-22在骨肉瘤组织中表达下调，且其表达与多种临床病理参数有关。miR-22可能成为预测骨肉瘤预后的生物标志物。由此可见，miR-22是抑制骨肉瘤发生发展的重要调节因子。

miR-22可能通过抑制ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase，ACLY)发挥抑制骨肉瘤细胞生长、促进骨肉瘤细胞凋亡的作用。miR-22是抑制ACLY的重要抑制剂，但miR-22干扰ACLY的具体机制尚不明确，仍需进一步研究。Xin等[32]采用实时定量PCR技术比较骨肉瘤、前列腺癌、宫颈癌和肺癌的恶性肿瘤细胞及相应正常对照组细胞miR-22的相对表达量，结果发现，上述4种恶性肿瘤的肿瘤细胞中miR-22的表达量明显低于相应正常对照组细胞；采用蛋白印迹法检测细胞中ACLY蛋白的表达发现，骨肉瘤、前列腺癌、宫颈癌和肺癌中ACLY的表达水平均上调；此外，为了进一步验证miR-22在恶性肿瘤细胞系中下调ACLY的作用，采用抗ACLY的蛋白印迹法进行分析发现，在骨肉瘤细胞(Saos-2)中，miR-22模拟转染组细胞ACLY蛋白水平较正常对照组细胞下降约50%；该研究还显示，原发骨肉瘤、前列腺癌、宫颈癌和肺癌临床标本的ACLY蛋白表达水平较高，miR-22表达水平较低，证实ACLY与miR-22存在负相关关系；在动物模型中，随着ACLY表达的丧失，经miR-22治疗小鼠的肿瘤体积减小、远处转移发生率降低。研究认为，ACLY是多种癌细胞脂质代谢通路中启动从头合成脂质过程的关键酶，在多种癌细胞中表达上调，并在癌组织中的表达和活性提高[33-34]。miR-22可通过抑制ACLY抑制新生脂肪生成，达到抑制肿瘤生长和转移的目的。综上所述，miR-22可以抑制骨肉瘤细胞的生长，促进其凋亡，这为骨肉瘤的治疗提供了新的思路。

2.2miR-22与骨肉瘤的侵袭和转移 miR-22不仅可抑制骨肉瘤的发生与发展，还对人体中骨肉瘤的侵袭转移有一定的抑制作用。Xin等[32]研究证实，miR-22可以直接抑制ACLY的表达，不仅可抑制骨肉瘤细胞生长、促进其凋亡，还可抑制骨肉瘤细胞的侵袭和转移。

Zhou等[35]共招募了7例骨肉瘤患者和7名健康志愿者，采用定量实时PCR和酶联免疫吸附试验检测受试者血清miR-22的表达，发现骨肉瘤患者和MG-63细胞株中miR-22的表达明显低于健康志愿者和正常成骨细胞株(hFOB 1.19)；利用细胞计数试剂盒检测MG-63细胞中miR-22和S100钙结合蛋白A11( S100 calcium-binding protein A11，S100A11)的关系发现，MG-63细胞中S100A11的表达与miR-22水平呈负相关；通过Transwell迁移实验和蛋白印迹法检测miR-22和S100A11对MG-63细胞增殖、迁移和蛋白表达的影响，发现miR-22的过表达抑制了MG-63细胞的增殖和迁移能力；通过测定顺铂处理后的细胞存活率和计算半数最大抑制浓度评价MG-63细胞对顺铂的敏感性发现，miR-22增加了MG-63细胞对顺铂的敏感性，反之，S100A11过表达则部分减弱了miR-22对MG-63细胞侵袭、转移、化疗耐药的抑制作用；荧光素酶报告实验验证，S100A11是MG-63细胞中miR-22的直接靶基因，即miR-22可能通过抑制S100A11表达抑制骨肉瘤细胞的侵袭与转移。

上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)是骨肉瘤侵袭转移的重要过程[36]。EMT过程会导致细胞上皮样特征减少和间充质样特征增加[37]，miRNA对EMT具有调控作用，锌指E盒结合同源蛋白1、Snail和Twist1是已知的3个调节EMT的关键转录因子[38-39]，但调控这一过程的特定分子事件尚不完全清楚，如miR-200能够抑制肿瘤细胞的耐药性和上皮表型[40-41]。Zhu等[42]通过定量实时PCR评估miR-22与Twist1的水平；通过功能性增殖实验、细胞形态学测量和蛋白印迹法评估miR-22在骨肉瘤中的作用；并通过荧光素酶报告实验确认Twist1与miR-22的相关性，结果显示，骨肉瘤肿瘤标本中miR-22水平较正常组织显著降低，miR-22水平的下调与肿瘤组织学分级显著相关；当miR-22过表达时，骨肉瘤细胞的增殖和EMT进展延缓；Twist1是miR-22的靶细胞，miR-22通过靶向Twist1遏制骨肉瘤细胞中的EMT过程，从而遏制骨肉瘤的转移发展，但其具体分子机制尚不清楚。

2.3miR-22与骨肉瘤的治疗 骨肉瘤具有很强的转移性及侵袭性，目前其治疗仍以手术联合化疗为主。由于不同个体的骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性不同，因此有些骨肉瘤患者的化疗效果并不理想，且随着化疗药物的长期使用，患者会出现不同程度的耐药[43]。研究发现，骨肉瘤患者化疗耐药性的产生是一个复杂的过程，涉及多种水平、因子、基因以及信号转导途径，包括自噬、DNA修复、miRNA的调控、线粒体的改变和EMT[44]。

近年来，miR-22、骨肉瘤细胞自噬及化疗耐药性已成为的相关研究热点。Zhou等[35]研究认为，miR-22抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移，增加顺铂敏感性，首次证明miR-22可能是骨肉瘤的重要治疗靶点，并可能作为骨肉瘤化疗药物联合治疗的一部分。而miR-22可调控多种自噬相关因子，进而降低甚至逆转骨肉瘤细胞对化疗药物的抗性。自噬是细胞成分分解与回收利用的基础，可以维持细胞内环境的稳态与正常的生理功能[45]。除参与细胞再生等正常生理功能外，骨肉瘤细胞生长及治疗中产生的耐药性与自噬息息相关[46]。自噬相关因子包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、高迁移率族蛋白(high mobility group proteins，HMGB)、unc-51样激酶1(unc-51 like kinase 1，ULK1)复合物、哺乳动物自噬基因Beclin-1等。

2.3.1mTOR PI3K/Akt通路在细胞自噬的调控中发挥重要作用。PI3K/Akt通路可以激活mTOR，而mTOR是自噬启动阶段的关键调节因子，mTOR通过调节Ⅰ型PI3K抑制自噬发生，从而降低骨肉瘤细胞对化疗药物的耐药性[47-48]。Meng等[49]研究发现，miR-22在信使RNA水平下调PI3K、Akt和mTOR的表达，在蛋白水平下调PI3K、磷酸化Akt和磷酸化mTOR的表达，减少顺铂诱导的自噬，从而介导骨肉瘤细胞对顺铂的抵抗，表明miR-22通过PI3K/Akt/mTOR途径抑制自噬，从而降低骨肉瘤对顺铂的耐药性。进一步的研究发现，在受顺铂影响的骨肉瘤细胞MG63中，miR-22在调节PI3K/Akt/mTOR通路方面的作用与PI3K抑制剂Wortmannin相似，PI3K抑制剂也能促进miR-22的作用。总之，下调PI3K/Akt/mTOR通路有助于预防化疗耐药。

2.3.2HMGB1 HMGB1是HMGB 家族的一员，含有两个串联的HMG盒结构域[50]。HMG盒是一种新型的DNA结合基序。当细胞受到各种不同的刺激时，HMGB1从细胞核迅速转移到细胞质或细胞外，通过与Beclin-1竞争性结合控制Beclin-1/Bcl-2复合体的形成，达到调节自噬进程的目的。HMGB1也可以与细胞表面受体相结合，从而激活下游信号通路，刺激细胞增殖，诱导自噬的发生[51]。HMGB1是重要的自噬调节因子。Huang等[52]发现，在骨肉瘤化疗过程中，HMGB1表达水平较高，可调节自噬，抑制HMGB1可提高骨肉瘤患者的化疗敏感性；相反，HMGB1过表达会促进自噬发生，增加化疗药物的耐药性。Li等[53]发现，骨肉瘤细胞中miR-22和HMGB1在化疗后被解除调控，HMGB1上调介导自噬并在体外导致骨肉瘤的化疗耐药。然而，作为一种代偿机制，miR-22在化疗过程中被上调，过表达miR-22靶向HMGB1的3′非编码区并抑制HMGB1，进而抑制自噬。可见，在骨肉瘤化疗耐药期间，miR-22和HMGB1对自噬的调节较复杂，miR-22在骨肉瘤细胞化疗耐药中发挥抑制作用。Guo等[54]研究亦发现，miR-22与HMGB1的3′非编码区配对，并能很好地下调HMGB1的表达，进而阻断HMGB1介导的体外骨肉瘤细胞化疗过程中的自噬，抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。

2.3.3ULK1复合物 细胞自噬通过ULK1复合物启动[55]。ULK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，位于人类第12号染色体q24.3，是人类细胞重要的自噬相关基因之一。ULKl基因有28 517个碱基，包含28个外显子，翻译成1 050个氨基酸。Zhu等[56]研究发现，阿霉素耐药骨肉瘤细胞中ULK1蛋白的表达上调，促进了自噬的发生。而miR-22过表达可显著降低ULK1蛋白的表达，部分逆转了阿霉素诱导的ULK1蛋白上调所引发的自噬，从而降低了骨肉瘤细胞对阿霉素的耐药性，表明miR-22对ULK1介导的骨肉瘤细胞自噬具有负调控作用。

异黏蛋白(metadherin，MTDH)与自噬调控关系密切[57]，miR-22/MTDH/自噬调控通路在骨肉瘤化疗耐药性中起关键作用。Wang等[58]研究发现，miR-22可通过抑制骨肉瘤细胞增殖以及下调MTDH介导的自噬来增强顺铂化疗敏感性，进一步抵抗骨肉瘤顺铂化疗的耐药性。Meng等[59]对人骨肉瘤细胞系(MG-63、U2OS、Saos2和OS9901)和顺铂(cisplatin，CDDP)耐药细胞系MG-63进行体外培养，用细胞增殖、凋亡和自噬实验检测转染miR-22的细胞，采用定量实时PCR和蛋白印迹法检测相关基因的表达水平，结果表明，miR-22能抑制MG-63细胞和MG-63/CDDP细胞的增殖，且miR-22诱导MG-63和MG-63/CDDP细胞凋亡并抑制自噬。凋亡相关的基因(胱天蛋白酶3和Bcl-2相关X蛋白)在转染miR-22模拟物的两种细胞系中表达上调，而Bcl-2表达下调。在两种转染miR-22模拟物的细胞系中，自噬蛋白C5、Beclin-1和微管相关蛋白均下调。此外，转染miR-22模拟物后，骨肉瘤/骨肉瘤-CDDP耐药模型中MTDH的体外和体内表达水平均下调。因此，miR-22通过抑制骨肉瘤细胞自噬和诱导细胞凋亡来促进CDDP的敏感性，而MTDH可能在诱导骨肉瘤细胞对CDDP的耐药中起积极作用。综上所述，miR-22可通过抑制多种自噬相关因子增加骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性，抑制化疗耐药的发生。这将是未来研究的重点。

3 小 结

miR-22能够抑制骨肉瘤细胞生长、促进骨肉瘤细胞凋亡、抑制骨肉瘤细胞侵袭与转移，并增加骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性，减少化疗耐药性。深入研究miR-22对发现骨肉瘤的潜在治疗靶点具有重要临床意义，为骨肉瘤的诊断和治疗提供了研究方向和手段。miR-22在骨肉瘤中的发生发展、侵袭转移以及化疗耐药等方面的作用机制尚未完全明了，随着科学技术的不断进步以及miR-22作用机制的逐渐清晰，骨肉瘤的诊断及治疗将取得新的进展。