Hedgehog信号通路在椎间盘退变中的研究进展

郝海静，郑洋，刘晓奇

(哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科，哈尔滨 150001)

椎间盘是连接于椎体之间强韧的软骨关节[1]，主要由位于椎间盘中心的髓核、包围髓核的纤维环及通过每个椎间盘顶部和底部连接相邻椎体的软骨终板构成[2]。椎间盘细胞长期处于低氧、低pH值、高渗透压和应力波动的恶劣环境中,与纤维环细胞相比，髓核细胞的营养供应依赖于椎间盘边缘血管的扩散作用，因此，机械应力、损伤和衰老等均会引起血液供应减少、软骨终板钙化，阻碍营养物质向椎间盘的运输，从而导致椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)[3]。全世界约有6.37亿人受腰痛的影响[4]，IDD已被证明是导致腰痛的首要危险因素，晚期IDD还可引起神经根痛、麻木、肌肉无力甚至瘫痪[5]，给患者带来身心痛苦的同时也增加了社会经济负担。因此，研究介导IDD的发病机制及治疗靶点、寻找早期检测IDD的敏感分子标志物成为亟待解决的问题。Hedgehog(Hh)信号通路是脊椎动物胚胎发育中的重要调控因子，同时参与骨的发育和内稳态的维持，是调控细胞命运的一种重要信号通路[6-7]。Hh信号通路在人类中的表达相对保守，主要包括Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)以及Desert Hedgehog(Dhh)三种同源蛋白，研究发现Shh及Ihh与IDD密切相关[6]。现就Hh信号通路在IDD中的研究进展进行综述。

1 Hh信号通路概述

Hh蛋白是目前已知的唯一同时具有棕榈酰和胆固醇基部共价修饰的蛋白，且此种共价修饰可自发进行[8]。Hh前体蛋白在内质网中可经自身剪切和脂质修饰产生C端结构域(Hh-C)及N端结构域(Hh-N)，其中Hh-C能共价结合胆固醇分子，并将其转移至Hh-N，随后在酰基转移酶的作用下，Hh-N的半胱氨酸发生棕榈酰化，最终产生具有完全活性的Hh-N，激活Hh信号通路[9]。Hh信号通路的转导依赖初级纤毛这一高度专业化、具有感受能力的细胞器。初级纤毛呈微管样并突出于细胞表面[10]，广泛存在于各类细胞表面，能感受并调节Hh信号通路[11]。

1.1经典Hh信号转导通路的组成 Hh信号通路有经典和非经典两条信号激活通路。经典的Hh信号转导通路涉及以下几个关键成分。①Hh配体：包括Shh、Ihh、Dhh三种，均含有Hh-N及Hh-C。②受体Patched(Ptch)：包括Ptch1、Ptch2两类，均为12次跨膜蛋白，是Hh信号的负性调节因子，其中Ptch1是主要受体类型，而Ptch2在信号转导中起次要补充作用[8]。③跨膜蛋白Smoothened(Smo)为7次跨膜蛋白，与G蛋白偶联受体同源，属于F类G蛋白偶联受体，具有3种状态：SmoA和SmoB呈未活化状态、SmoC呈活化状态，是Hh信号的换能器[12]。④效应蛋白为转录因子Gli，是由GLI基因编码且具有锌指结构，在脊椎动物中有3种亚型：Gli1参与激活目的基因转录，Gli2和Gli3既能激活又能抑制目的基因的转录[13]。⑤下游靶基因：包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(fused，Fu)、Fu抑制剂(SuFu)、驱动蛋白样分子2(Cos2)、蛋白激酶A、Hh相互作用蛋白等，在Hh的信号转导过程中Fu起促进作用；而SuFu、Cos2、蛋白激酶A、Hh相互作用蛋白等起抑制作用[14]。

1.2经典Hh信号的调节过程 位于初级纤毛底部的Ptch在无Hh配体时与Smo形成复合物，这阻碍了Smo向初级纤毛的转移、运输和定位，从而抑制其活化，同时阻塞了SuFu与Gli分离所需的信号级联，Gli则被依赖环腺苷酸的蛋白激酶A磷酸化后分解为Gli抑制物，Gli抑制物抑制细胞核内目的基因转录。蛋白激酶A的调节亚基和催化亚基均位于纤毛基底部，感受环腺苷酸促进Gli抑制物的生成，这一过程导致Gli转录因子失活，下游Hh信号转导暂停[15]。当初级纤毛感受到Hh信号时，Hh与Ptch受体结合，Smo进入原纤毛，抑制蛋白激酶A从而引起Gli与SuFu的解离，激活Gli，同时解除对Smo的抑制作用，Smo即向初级纤毛内转移，到达纤毛顶端与SuFu相互作用，使Gli活化，激活的Gli(GLIA)从Gli-Cos2-Fu-SuFu组成的胞质复合物中游离出来，以全长形式进入核内激活下游靶基因成员与目的基因启动子结合，使目的基因转录，进而产生生物学效应[14]。由此可见，经典的Hh信号激活通路依赖Hh配体和Smo[16]，而非经典通路则不依赖Hh和Smo，可通过其他信号(如Wnt、转化生长因子-β)直接激活Gli使其转录[17]。

2 Hh在椎间盘发育形成过程中的作用

脊椎动物均有一段椎骨和椎间盘交替的节段，该节段在胚胎发育中起源于中胚层的脊索和体节，分别是形成椎间盘和脊柱的结构[18]。椎间盘在胚胎发育过程中，纤维环来自间叶[19]，而髓核起源于脊索[20]。Hh在椎间盘形成过程中发挥重要作用，已有研究证明，在胚胎椎间盘形成过程中，Shh主要在小鼠脊索细胞中高表达[21]，而Ihh主要在小鼠胚胎椎体的软骨细胞样细胞以及后期形成的软骨终板中高表达[22]。巩婷婷和陈建权[23]研究表明，在小鼠胚胎椎间盘形成过程中，ShhCreERT2能在小鼠胚胎的早期阶段特异性靶向标记髓核细胞，而在椎间盘形成后期，髓核细胞内Shh表达水平逐渐降低；相反，Ihh在椎间盘形成的早期表达水平较低，在脊索细胞内几乎不表达，但到发育后期，髓核细胞内则开始出现大量的Ihh。另有研究证明，在椎间盘成熟期间，较大、空泡样的脊索细胞被较小的、非空泡样的软骨细胞样细胞所取代，这一过程在人出生时就已基本完成[24]。以脊索细胞丢失为特征的年龄相关性椎间盘病变从儿童时期就已开始，30岁以下人群中有40%，55岁以上人群中有90%出现结构性IDD[25-26]，提示IDD的发病与脊索细胞的凋亡和消失密切相关。可见，Shh和Ihh在椎间盘的发育形成过程中发挥着不同的作用：Shh是调控脊索细胞分化为髓核细胞的重要信号通路，而Ihh与椎间盘胚胎发育后期软骨终板的形成密切相关；Shh信号的生理性沉默或Ihh信号异常激活可能诱导脊索细胞凋亡，进而导致IDD的发生；同时，这两种Hh信号通路在椎间盘形成及退变过程中具有时间递进关系，提示可能存在一个潜在的中间作用靶点，其在终止上游Shh信号调控椎间盘发育成熟的同时启动下游Ihh信号参与IDD，但有待深入研究和证实。

3 Ihh信号通路在IDD中的作用

3.1Ihh信号通过诱导软骨终板钙化加剧IDD Hh信号通路被认为在胚胎发育成熟后成为沉默通路，但可在缺血、组织损伤、严重的机械负荷等病理条件下被激活[27]。Ihh是软骨细胞中主要的Hh配体，已被证明在膝关节软骨变性中发挥重要作用，在人和鼠骨关节炎组织中被激活[28-29]。Runt相关转录因子2是与成骨相关的关键转录因子，也在软骨细胞中表达并激活基质金属蛋白酶13和Ⅹ型胶原的表达，Gli2和Gli3已被证明是Ihh通路中促进Runt相关转录因子2表达的主要信号分子[30]。在所有的胶原种类中，Ⅹ型胶原被认为是软骨细胞肥大的标志，并参与钙化形成[31]。Wang等[32]收集了接受腰椎融合手术且磁共振成像显示终板发生ModicⅠ、Ⅱ型改变患者的终板软骨标本，对比无Modic改变的腰椎爆裂术后患者的终板软骨标本，通过体外培养软骨终板细胞进行免疫组织化学法分析发现，存在Modic改变的患者软骨终板细胞标本中Ihh的表达明显升高且与变性的严重程度呈正相关，同时，在退变的软骨终板细胞中，除Ihh外，下游靶基因Gli1、Gli2、Gli3及基质金属蛋白酶13、Ⅹ型胶原的表达也被上调，表明在退变的软骨终板细胞中，Ihh信号转导通路的异常激活可能通过上调Gli基因的表达使骨化相关基因过表达，进而诱导软骨终板细胞发生钙化而加剧IDD。可见，Ihh信号的异常激活与IDD密切相关，Ihh可能成为IDD潜在的生物标志物和治疗靶点。

3.2Ihh-甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrP)负反馈通路延缓IDD Ihh被认为主要在生长板和关节软骨水平上具有生物学作用[33]。PTHrP广泛表达于人体骨、心、肾、脑、皮肤等器官组织并介导相关生理作用。已有研究表明，在生长板水平上，Ihh和PTHrP在软骨内骨化过程中存在调节软骨细胞分化的负反馈通路：由前肥大生长板软骨细胞产生的Ihh可促进软骨细胞的增殖和分化，而关节周围软骨细胞产生PTHrP可阻止增殖的软骨细胞离开增殖生长板区，当PTHrP靶向过表达时会阻碍肥大软骨细胞的产生，而软骨细胞的数量不足以再被PTHrP刺激时，Ihh的合成与软骨细胞的增殖将会停止[33]。Bach等[34]分别通过体外去分化实验、实时定量聚合酶链反应及免疫组织化学法分析对比了犬和人椎间盘成熟过程中脊索细胞表型的自然丧失期间和IDD期间PTHrP、Ihh及两者相关受体的表达情况，结果显示，在椎间盘失去脊索细胞表型的过程中，PTHrP及其受体1和Ihh受体的表达逐渐下降；在成熟或变性期间，Ihh的表达无变化；而在椎间盘变性期间，PTHrP及其受体1和Ihh受体的表达增加，同时Ihh具有在体外诱导软骨细胞样细胞钙化的倾向，而PTHrP未见影响钙化水平，推测可能是由于PTHrP在体内抑制了椎间盘钙化过程，则在后期的表达不会被上调。因此，Ihh-PTHrP负反馈通路在体内可能具有抑制Ihh蛋白表达从而延缓椎间盘钙化的作用，同时，抑制Ihh信号可能是治疗IDD的一种方法。然而，Ihh-PTHrP负反馈通路介导IDD的具体机制仍不明确，其与受体Ptch、转录因子Gli及跨膜蛋白Smo等在IDD中的作用关系是未来研究的重要方向。

4 Shh协同其他蛋白通路逆转IDD

Shh与椎间盘的形成和维持有关[35]，Choi和Harfe[36]通过使用他莫昔芬诱导Shhflox/CreERT2等位基因小鼠胚胎，在8.5～10.5 d时条件性地靶向抑制Shh，发现椎间盘和椎骨形成缺陷，阐明了Shh在脊索鞘和脊索细胞形成中的关键作用，表明Shh信号对于胚胎早期的椎间盘形成至关重要。Winkler等[1]对小鼠模型的体内和体外实验表明，来自髓核细胞的Shh信号转导受到经典Wnt信号转导的控制，这两种通路均随着年龄的增长而下调，并伴随椎间盘中细胞外基质和其他分化标志物的表达水平下降。在老化的椎间盘中，这两种通路的活动均下调，但这种下调是可逆的，通过激活退变椎间盘中的Wnt和Shh通路可以上调随老化而丢失的椎间盘分子标志物的表达。近年的研究表明，Shh信号转导通路可以在成年和老年小鼠的椎间盘中被重新激活，仅细胞子集的初始激活就足以重新激活和再生整个椎间盘[37]。因此，针对Wnt和Shh信号通路的生物疗法作为治疗IDD的方法可能是可行的。此外，Casey等[38]研究表明，Shh信号还可抑制骨形态发生蛋白信号的转导，而促进新生小鼠椎间盘中的转化生长因子表达从而延缓IDD。然而，Shh与Wnt信号、骨形态发生蛋白和转化生长因子途径在IDD中相互作用的分子机制尚不清楚，有待进一步研究。可见，Shh发挥延缓甚至逆转IDD的作用需要多条通路协同参与，Shh信号有望作为中间共同信号转导通路成为椎间盘再生研究的高效作用靶点。

5 Hh信号抑制剂在IDD中的研究现状

Hh信号抑制剂的研究对于深入阐明Hh信号在IDD中的作用和寻找延缓甚至逆转IDD的治疗靶点具有重要意义。Hh信号抑制剂主要包括Hh配体抑制剂、Smo拮抗剂、Gil抑制剂等，分别在Hh信号通路的不同水平发挥作用。其中，Hh配体抑制剂在骨关节炎及软骨变性中研究最多，包括一些植物提取物也被发现能够抑制Hh信号通路，如白藜芦醇及环巴胺等[39]。宋先兵等[40]研究证明，使用环巴胺溶液处理佐剂性关节炎大鼠软骨细胞24 h后，Shh、Ptch1及Gil蛋白的表达水平均有下降趋势，且差异有统计学意义，表明体外环巴胺给药可显著抑制Hh信号通路的活化。Guo等[41]研究证明，伊普黄酮作为种新型、安全的Ihh信号抑制剂，可以通过阻断Ihh信号通路来减缓软骨变性，为大鼠创伤后骨性关节炎提供软骨保护。但目前上述抑制剂在IDD中的作用均鲜有报道，由于关节软骨与椎间盘的组成具有一定相似性，且骨关节炎与IDD的发病均被证明与Hh信号通路有关，环巴胺和伊普黄酮应用于IDD具有较大研究价值。然而，现有Hh信号抑制剂(Ihh或Shh抑制剂)的相关研究存在许多问题：①特异性靶向抑制Ihh或Shh的药物有待证明，目前研究报道仅通过免疫组织化学等实验方法间接证明Ihh或Shh表达升高或下降，这可能与含生物活性的N端在Ihh和Shh具有很高的同源性，且两者共享下游信号转导通路有关；②由于Ihh和Shh在椎间盘发育及退变不同时期中的特殊作用，仅单一研究Ihh或Shh在IDD中的作用可能导致研究结果的偏差，如只证明抑制Ihh信号可延缓IDD，而忽视Shh可能同时因IDD异常激活而产生同样的椎间盘再生作用；③Hh信号抑制剂在椎间盘细胞中的毒理作用仍需通过动物实验进一步阐明，为后期开发安全、高效的药物应用于IDD治疗提供依据。

6 结 语

Hh信号通路与IDD关系密切且复杂。首先，在胚胎椎间盘的形成阶段，Ihh与Shh分别在不同时期发挥介导椎间盘形成和发育成熟的作用，而这一作用在成年期随着Hh信号的沉默而消失；但椎间盘变性时，Ihh信号级联反应的异常激活可进一步上调下游靶基因的表达，进而诱导甚至加重IDD，而Shh信号的激活则使IDD的逆转成为可能。其次，由于Ihh与Shh共享下游信号转导通路，两者在介导IDD中的作用仍不明确，甚至在不同的研究中得出相互矛盾的结果，有待于进一步深入研究。此外，Hh信号通路的激活还受其他细胞信号通路的影响，表明Hh信号可能是介导IDD的共同中间通路。最后，Hh信号通路的抑制剂在IDD中的研究鲜有报道，应作为今后研究的一个重要方向。总之，Hh信号通路在IDD中的研究前景广阔，值得通过改进和完善实验方法深入研究。