人乳头瘤病毒致宫颈癌变机制研究进展

于艳芳 魏芳

2018年全球185个国家中，宫颈癌新发病例569 847例，死亡病例311 365例，其发病率和死亡率在全球女性恶性肿瘤中均居第四位，且发展中国家宫颈癌发病率高于发达国家[1]。95%的宫颈癌是由高危型人乳头瘤病毒(High risk human papillomaviruses，HR-HPV)持续感染引起。不同的HPV分子感染持续时间和致癌潜能不同，过去对此差异的研究以HPV类型为基础，随着基因组学的发展，逐渐认识到同一类型的HPV内存在不同的变异谱系和亚系，且不同变异谱系和亚系的致癌潜能也有明显的差异[2-4]。HR-HPV的免疫逃避机制导致其感染的持续性，HR-HPV通过癌蛋白E6和E7分别与p53和pRb结合发挥致癌的主要作用。此外，HR-HPV可以增加宿主细胞基因组的不稳定性，导致体细胞突变的积累，以及通过其介导的载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽(APOBEC)突变共同发挥致癌作用[5-6]。

一、HPV结构

HPV是一种双链环状DNA病毒，长度约8 000碱基对，含有8或9个开放阅读框(ORFs)，包裹在无包膜衣壳蛋白内。病毒基因可分为三个主要区域：(1)早期区域(E)。编码病毒周期所必需的基因，并在细胞转化中起重要作用(E1、E2、E4、E5、E6和E7)；(2)晚期区域(L)。编码病毒颗粒的主要外壳蛋白L1和次要外壳蛋白L2；(3)上游调控区(URR)。也称为长控制区(LCR)，是含有复制起点和转录因子结合位点的非编码区，通过控制病毒基因转录调节DNA复制。尽管不同HPV分子ORF的大小和数量存在差异，但所有HPV都含有保守的核心基因参与复制(即E1和E2)和包装(即L1和L2)，其余基因(即E4、E5、E6和E7)在驱动细胞周期、免疫逃逸和病毒释放方面发挥作用。

二、HPV各水平分类

HPV是一个庞大的病毒家族，依据病毒基因遗传差异其分类水平逐层向下依次是：属、物种、类型、变异谱系和亚系[2-4]。HPV依据L1基因结构和对人类上皮组织的趋向性不同分为五个属：α-、ν-、μ-、β-和γ-属，不同属HPV病毒L1基因的核苷酸序列同一性<60%，其中导致宫颈癌的主要是α-HPV[2]。属内引入术语“物种”，同一物种HPV病毒L1基因的核苷酸序列同一性≥70%，如α-HPV又分α-1、α-2、α-3……α-14等14个物种[3]。同一物种内，HPV病毒L1基因的核苷酸序列差异≥10%即定义为一种HPV类型，如α-7物种组内有HPV18、HPV39、HPV45、HPV59、HPV68、HPV70、HPV85和HPV97，α-9物种组内有HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52、HPV58和HPV67，目前已鉴定出200多种HPV类型[3]。HPV类型内又存在不同变异体，即变异谱系和亚系，其内部全部病毒基因组序列差异分别为1%～10%和0.5%～1%，以HPV16为例，迄今已鉴定出HPV16的4个变异谱系(A、B、C和D)和16个亚系，分别为：亚系A1-3(见于欧洲)、A4(亚洲)、B1-4(非洲)、C1-4(非洲)、D1(北美)、D2和D3(亚裔美国人)和D4[3-4]。

三、不同HPV分子致癌潜能不同

α-属HPV中的一些HPV类型易感染粘膜上皮，并可能导致良性无症状感染、生殖器疣或宫颈癌等多种疾病[2]。约60个α-HPV类型中，12个被WHO定义为I类致癌物，分别是α-9物种组中的HPV16、HPV31、HPV33、HPV35、HPV52和HPV58，α-7物种组中的HPV18、HPV39、HPV45和HPV59，α-5物种组中的HPV51和α-6物种组中的HPV56[2]。一些研究表明，HPV的不同变异体在感染持续性、进展为宫颈癌前病变和癌症方面具有不同风险。

HPV16是目前已知的最高危HPV类型，与大约50%的宫颈癌相关，感染HPV16非A变异谱系(即B、C和D)的女性发展为宫颈癌的风险比感染HPV16-A变异谱系的女性增高1倍[4]。HPV16亚系A4、D2和D3在宫颈原位腺癌(AIS)和腺癌(ADC)中更常见，而A1、A2亚系见于大多数(75.4%)宫颈鳞癌中[4]。2016年，美国科研工作者使用高通量HPV全基因组测序分析了3 215名感染HPV16妇女的HPV16变异谱系和亚系，分析其与宫颈癌和宫颈上皮内瘤变III级(CINIII)的风险，结果显示：A4亚系癌症风险较高，特别是腺癌，谱系B具有较低的CINIII风险，D2、D3亚系与CINIII和癌症风险增加密切相关，D2具有最强的腺体病变风险[4]。表明HPV病毒较小的遗传差异即能导致致癌潜能的变化。

HPV18存在3个变异谱系(A、B、C)和9个亚系(A1-5、B1-3、C)，HPV18 -A变异谱系(见于欧洲)导致CINIII的风险是B、C变异谱系(见于非洲)的2倍，亚系A1、A2导致腺癌的风险比亚系A3、A4高4倍[3]。

HPV31存在3个变异谱系(A、B、C)和7个亚系(A1-2、B1-2、C1-3)。目前关于HPV31变异体与感染持续性的关系尚有争议，有报道认为HPV 31-C变异谱系比A、B变异谱系感染持续时间更长，亦有报道认为A和B谱系与持续感染和疾病进展相关，谱系B与CINIII关系密切[3]。

HPV52存在4个变异谱系(A、B、C和D)和7个亚系(A1-2、B1-2、C1-2和D)。来自台湾的一项大型研究表明，谱系C在导致HSIL及以上级别的病变中风险是谱系B的7.6倍[7]。加拿大的一项研究表明A1亚系在CIN II/III中更为常见[8]。

变异体的研究对于解决HPV发病机制的遗传基础、病毒-宿主相互作用、导致特定组织病理癌症的特定核苷酸或核苷酸组合等的研究意义重大，需要更多的多中心研究及荟萃分析来解决HPV相关癌症核苷酸水平和分子水平的发病机制。

四、HPV生命周期及其免疫逃避机制

大多数肛门生殖器HPV感染是通过性接触获得的。既往认为HPV感染需要上皮创伤或微创伤以允许病毒进入基底层，并提出伤口愈合反应在受感染细胞增殖中的作用，随着研究进展，鉴于HPV类型和感染途径的多样性，感染途径不再一概而论，并认为在伤口愈合期间发生的活跃细胞增殖是病毒基因组进入细胞核所必需的[2]。HPV生命周期与受感染上皮细胞的分化程度密切相关，HR-HPV更易感染具有增殖能力的基底层细胞，其在一定程度上决定了HR-HPV感染的持续性，感染分两个阶段：潜伏感染和生产性感染[9]。在潜伏感染期间，病毒基因复制水平较低，每个细胞产生约50～100个病毒基因组，且病毒基因组存在于上皮细胞内不向体液中释放，故而逃避机体的免疫反应，这种现象在HR-HPV中更常见[5]。有体外研究表明HPV16表达由E1和E2开放阅读框的亚区(称为E8E2)编码的融合蛋白，限制病毒在未分化的角质形成细胞中完成病毒生命周期的转录和复制[10]。生产性感染阶段，E6和E7高度表达，E2蛋白将E1(一种病毒DNA解旋酶)募集到病毒复制起点的结合位点，促进病毒DNA复制，导致在分化成熟的角质形成细胞中每个细胞产生数千个病毒基因组拷贝[9]。在上皮细胞分化成熟后，HPV基因组编码合成L1和L2衣壳蛋白，组装成新的HPV颗粒从上皮表面释放，使感染扩散[11]。

此外，HPV免疫逃避的机制还包括调节干扰素信号传导、通过E6和E7癌蛋白抑制朗格汉斯细胞、抑制粘附分子如CDH1以及调节细胞内信号传导途径等[12]。一半多的女性在HPV感染后的6个月内可自行清除病毒，超过90%的感染女性在几年内可以清除，不会引起症状，即使产生症状大多数患者会自发消退，小部分HPV感染持续存在发展为癌症。仅有极少数的患者在HPV自然感染后产生HPV抗体，但经此途径产生的抗体在抵抗新一轮的HPV感染时其有效性远低于高水平血清反应和接种HPV疫苗后产生的抵抗力[13]。

五、HPV致癌机制

1.致癌基因激活和抑癌基因失活：HR-HPV编码的E6癌蛋白与宿主细胞编码的E6AP形成的复合体，与肿瘤抑制基因p53结合，使p53失活、降解，丧失与促凋亡bcl-2阴性调节区域和抗凋亡的bax促进子区域的结合能力，从而抑制凋亡，增加染色体不稳定性，使细胞过度增殖导致肿瘤[11]。E7能与非磷酸化pRb优先结合，使pRb-E2F发挥转录因子作用，经过反馈环的增量调节引起p16INK4A过度表达，使控制细胞周期的转录脱调节，引起细胞过度增殖[11]。此外，E6能激活端粒酶活性，E7能使细胞周期失调、细胞增殖、增加基因组不稳定性并促进染色体异常的积累，均可促进上皮细胞转化[11]。

2.HPV整合与基因组不稳定性：基因组不稳定性的发展是HR-HPV致癌过程中恶性进展的标志。

HPV病毒基因与宿主基因的整合可能是轻度鳞状细胞上皮内瘤变向重度鳞状细胞上皮内瘤变进展的早期事件，因此可能是癌症进展的生物标志物[14]。宫颈癌中HPV整合程度因HPV类型而异，与HPV16、18和45相比，HPV31和33的整合频率较低，约74%的HPV16相关癌症发生了基因整合，几乎所有HPV18相关癌症均发生了基因整合[6]。在HPV变异谱系水平上，研究发现不同变异谱系可能因E6活性不同，其整合潜力不同[6]。基因整合通常发生于DNA损伤后无法修复的染色体脆性位点，DNA损伤通常由活性氧、活性氮和HPV蛋白E1、E6和E7等诱导[15]。宿主细胞DNA损伤后，HPV癌蛋白通过多种方式对抗细胞的DNA损伤应答(DNA damage response，DDR)反应，使DNA断点无法修复以利于病毒基因整合[16]。整合导致病毒基因E1、E2、E5和L2被破坏，E6和E7癌基因缺乏E2癌蛋白的抑制作用而过表达[17]。E6 / E7的过表达导致细胞周期的失调并促发几条致癌途径。

E6和E7通过干扰有丝分裂期间着丝粒的复制和诱导中心体数量异常，直接增加基因组不稳定性，这可能导致大的染色体重排和拷贝数变异[18-19]。宫颈癌在癌症基因组网络图谱(TCGA)数据集中平均有88个基因拷贝数改变，包括26个扩增和37个丢失，扩增最常见于3q(50%的癌症和25%的CINIII)，该区域含PIK3CA基因，丢失最常见于3p(40%的癌症和10%的CINIII)[6]。宫颈鳞癌中报告的拷贝数变异多于宫颈腺癌[6]。研究表明，HPV相关的宫颈癌中，拷贝数变异通常发生在病毒整合位点[6]。

由E6和E7激活的致癌过程需要宿主基因突变的累积共同发挥作用，不同的HPV基因型致癌过程中所需的体细胞突变负荷和类型可能存在差异，迄今，TCGA已经鉴定了宫颈癌的14个显著突变基因，分别是SHKBP1、ERBB3、CASP8、HLA-A、TGFBR2、PIK3CA、EP300、FBXW7、HLA-B、PTEN、NFE2L2、ARID1A、KRAS和MAPK1，其中，HLA-A、HLA-B、NFE2L2、MAPK1、CASP8、SHKBP1和TGFBR2的突变仅在宫颈鳞癌中发现[6]。

3.宫颈癌的表观遗传修饰和miRNA表达水平的变化：表观遗传修饰是宫颈癌的一个重要特征，HPV和宿主基因的甲基化通过影响病毒基因的复制、细胞周期的调控、细胞凋亡和DNA修复等途径促进肿瘤的发生。HPV基因组中的LCR是E2结合位点，具有潜在甲基化的CpG位点，其甲基化导致E2功能的抑制，使游离状态下的E6、E7过表达[20]。有研究发现，HPV16 LCR的CpG甲基化随着宫颈新生血管的增多而增加[21]。宿主细胞中的凋亡基因DcR1和DcR2在侵袭性癌症中高度甲基化[22]。甲基化在侵袭性宫颈癌和CINIII中比在CINI～II中更常见。此外，HPV和宿主基因的甲基化可能受HPV整合和基因型的影响。

miRNA是非转录RNA，通过诱导细胞增殖、凋亡和基因组不稳定在宫颈癌变过程中发挥作用[23]。HPV癌蛋白及基因整合可以调节miRNA的表达水平，从而在肿瘤的发生中发挥作用，例如：E6癌蛋白降解p53，导致由p53调节的所有miRNA(miR-23b、miR-34a和miR-218等)的表达下调，E7通过E2F1失活诱导miR-15/16的过表达，导致c-myc或c-myb的下调[24-25]。miRNA在正常宫颈组织和宫颈病变组织中的表达水平差异较显著，故其可能作为宫颈癌诊断和预后的生物标志物，但需更多的研究才能在临床应用中进行验证。

4.HPV介导的APOBEC突变：HR-HPV癌蛋白E6和E7的另一个目标是载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3(APOBEC3)，有研究表明，由于宿主对HPV感染的免疫反应引发的载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽(APOBEC)突变是HPV阳性肿瘤主要的突变来源[6,11]。APOBEC3是一种胞嘧啶脱氨酶蛋白，APOBEC3家族由七种不同的蛋白质组成，已经发现其成员APOBEC3A和APOBEC3B受E6和E7的调节在HPV阳性癌症中高表达[26-27]。机制之一是，HPV16 E6通过p53的降解上调TEAD1/4，导致APOBEC3B的转录增加[28]。第二种机制是HPV16 E7通过APOBEC3A上的Cullin-2结合基序与APOBEC3A结合，该复合物的形成阻止了APOBEC3A的降解，但APOBEC3A酶的活性不变[29]。APOBEC3A/B酶的作用机制为在TCW(T：胸腺嘧啶，C：胞嘧啶，W：腺嘌呤或胸腺嘧啶)基序中使胞嘧啶脱氨基突变为胸腺嘧啶或鸟嘌呤(G)，即：TCW→TTW和TCW→TGW突变，统称为“TCW”突变[29-30]。APOBEC3A在病毒感染宿主细胞时通过结合并编辑病毒DNA限制病毒感染，但APOBEC3B在细胞核中表达，在DNA修复过程中，APOBEC3B介导的胞嘧啶脱氨作用可能参与HPV致癌过程。TCGA报告了228例原发宫颈癌的广泛分子特征，观察到其中192例HPV相关宫颈癌中150例富含APOBEC突变[6]。

六、结语

综上所述，HR-HPV持续感染是宫颈癌发生的主要原因，HPV病毒不同变异体的致癌潜能不同，对HPV变异体的研究有助于从核苷酸水平或分子水平了解HPV致宫颈癌变的机制。HR-HPV感染宿主细胞后通过其免疫逃避机制逃脱机体的免疫反应，病毒基因组通过宿主细胞的DNA损伤点整合入宿主基因组，整合导致E2癌基因被破坏而E6、E7过表达，过表达的E6、E7癌蛋白通过激活致癌基因、抑制抑癌基因、干扰有丝分裂、调节miRNA的表达量以及增加宿主细胞体细胞的突变等途径导致宫颈癌的发生。研究表明，病毒基因的整合可能是LSIL向HSIL进展的早期事件，且miRNA在正常宫颈组织和宫颈病变组织中的表达水平差异较显著，故对其的进一步研究可能为宫颈癌恶性程度的早期判断及预后提供较为准确的生物学指标。虽有研究提出由HPV介导的APOBEC突变可能系HPV相关肿瘤的主要突变来源，但目前证据不足，需要进一步的研究来确定两者是否相关。