中性粒细胞胞外诱捕网在呼吸道中的作用研究进展

王逸凡，代蓉，晏雪梅，李爽，李秀芳

(云南中医药大学药理教研室，昆明 650500)

中性粒细胞是体内最丰富的白细胞，约占已发现人体循环血液中白细胞总量的60%[1]。中性粒细胞作为机体固有免疫防疫系统的重要组成部分，可在有毒颗粒蛋白和活性氧类的帮助下，吞噬和杀死与之相适应的细胞外病原体[2]，也可以通过分泌毒性蛋白和酶[髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)和防御素等]对抗细胞外微生物。此外，中性粒细胞可将活性氧类和一些促炎细胞因子释放到细胞外微环境中，协助先天免疫反应[3]。因此，中性粒细胞构成了机体抵抗有害病原微生物入侵的一道防线。但近10年的研究发现，中性粒细胞是更为复杂的细胞，不仅具有先天免疫应答的效应功能，还具有通过与细胞因子直接相互作用或产生细胞因子来调节适应性免疫应答的能力[4-6]。2004年，Brinkmann等[7]首次发现了中性粒细胞对抗感染的另一种方式，即形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs是经刺激活化的中性粒细胞的细胞核内成分释放至胞外而形成的一种网状结构。研究发现，NETs在捕获和灭活细菌、真菌和病毒方面起关键作用，但NETs过量聚集时，其对机体的保护作用易转为损害作用[5]。现从NETs的结构、标志物、抗菌抗病毒及呼吸系统相关炎性疾病等方面进一步阐述NETs在呼吸道免疫过程中的双向作用，为进一步探究NETs在上呼吸道感染向下呼吸道迁延进程中的关键作用提供新思路。

1 NETs的形成

与凋亡和坏死不同，NETs形成是一种新的中性粒细胞程序性死亡方式，是一个多步骤的死亡途径，被称为NETosis[7-8]。通过将中性粒细胞与抗死亡受体——Fas抗体孵育后诱导细胞凋亡，凋亡的中性粒细胞出现染色质缩合、细胞核破碎以及细胞质空泡化，而核膜和细胞器保持完整。坏死中性粒细胞的细胞核结构破坏，核小叶融合成均质团块，但未分离成常染色质和异染色质。与凋亡和坏死的中性粒细胞相比，NETs最显著的形态学差异是中性粒细胞核膜与胞质颗粒膜溶解，染色质与胞质内颗粒内容物的融合以及胞质细胞器的消失[9-10]。

目前已发现的NETs形成方式主要有自杀式NETosis和活性NETosis两种。在自杀式NETosis中，中性粒细胞在受到促炎介质、过氧化物等刺激后2～4 h内活化，活化的成熟中性粒细胞呈扁平状，并黏附于基底面，核染色体解聚，分叶结构消失，内、外核膜分离，颗粒膜、核膜消失，细胞核质、细胞胞质与颗粒成分融合，细胞变圆收缩直至胞膜破裂，细胞内容物呈网状排出[10]。12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇是常用的自杀式NETosis诱导剂，可通过激活蛋白激酶C活化泛素连接酶-促分裂原活化的蛋白激酶-胞外信号调节激酶信号转导通路，激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，进而促发NETs释放[11]。肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-8等促炎介质也能通过激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸信号诱导NETs产生[12]。此外，中性粒细胞在受到高迁移率族蛋白B1、脂多糖、革兰阴性菌等刺激后，还可形成活性的NETosis，但并不在5～60 min内出现核膜或质膜破裂。活性NETosis受到刺激后，细胞核的小叶和多核形状消失，细胞内外膜分离且囊泡出芽。细胞质与质膜融合后释放到胞外与DNA结合[13-14]，此时中性粒细胞仍具有活性并能够吞噬病原体[15]。活性NETosis依赖于Toll样受体和补体蛋白的参与[16]。

研究表明，NETs的形成需依赖胞内NE和MPO。NE和MPO协同易位至细胞核内，降解组蛋白，使染色体去浓缩，促进组蛋白瓜氨酸化[9]。NE缺陷型小鼠不能形成NETs，表现出免疫缺陷。临床研究发现，MPO活性缺乏患者不能生成NETs[17]，除NE和MPO外，细胞内肽酰基精氨酸脱亚胺酶4也被认为是NETs形成必不可少的因素。在NETs形成过程中，组蛋白高度纤维化介导染色质去致密化是其网状结构形成的关键[18]，而肽酰基精氨酸脱亚胺酶4催化去除组蛋白H3精氨酸残基上带正电荷的-NH2基团，促进组蛋白修饰转变成瓜氨酸化组蛋白，以削弱核小体中组蛋白和DNA之间的紧密静电结合，随后DNA骨架解螺旋，与抗菌蛋白颗粒结合，使细胞破裂和NETs释放[9]。研究表明，NETs存在于多种脊椎动物(人、小鼠和半滑舌鳎鱼)中[19-21]。

2 NETs的结构及标志物

通过电子扫描和共聚焦显微镜以及蛋白质组学分析对NETs的详细解析显示，NETs由薄的染色质纤维组成，其中包含约30种中性粒细胞蛋白，包括NE、杀菌/通透性增强蛋白、防御素、抗菌肽LL-37、蛋白酶3和粒细胞来源的组织蛋白酶G以及核组蛋白[22]。这些镶嵌在DNA骨架上的蛋白增加了NETs局部杀菌浓度。NETs占据的体积可超过其来源细胞体积的10～15倍，且有多种形态，如丝状结构、网状结构、云状结构[23]。NETs主要依靠其独特的三维网状结构捕获病原体，主要由球状结构及光滑延伸的脆弱纤维组成，这种独特的结构为NETs发挥生物学作用提供了结构基础。脱氧核糖核酸酶可降解网状结构，故认为核DNA是NETs结构的支柱[24]。NETs的相关文献指出，NE从细胞质转移至细胞核，并通过降解组蛋白促使染色质去浓缩，而组蛋白的瓜氨酸化介导染色质去浓缩和NETs形成[18,25]。综上所述，核DNA、NE以及组蛋白可作为NETs的特征标志物。

3 NETs在呼吸道中的双向作用

中性粒细胞抵抗病原体的经典途径主要通过趋化移行，从血管移至炎症部位，吞噬病原变为吞噬体[26]，吞噬体与细胞内含有酸性水解酶和抗菌肽的特殊溶酶体相互作用，结合成吞噬溶酶体后被分解。而NETs的网状结构可防止病原体的扩散，并维持抗菌物质在感染部位的聚集，更好地发挥清除和杀灭一些病原体及其毒力因子的作用[8]。NETs作为机体先天性免疫的重要环节，在抵抗御病原体侵袭方面起积极作用。当病原体入侵机体时，NETs能迅速形成并迁移到感染部位，捕获并限制病原体，再通过高浓度的抗菌分子杀灭病原体，为机体提供有效的抗菌防御保障。此外，NETs还可能作为免疫效应和促炎因子的来源，促进组织损伤和自身免疫[27]，NETs的形成伴有大量胞内和核内自身抗原的暴露[28]，若NETs过度形成或未及时清除，其富含水解酶和DNA的粘连网状结构附着于内皮，可引起内皮细胞凋亡，直接导致组织损伤，同时也可通过释放抗菌肽LL-37、α干扰素等内源性危险信号，诱导自身免疫[29]。研究表明，体内过度形成NETs与许多呼吸系统疾病的病理过程有关[30]。

3.1NETs的防御功能

3.1.1抗菌作用 NETs在防御各种细菌方面起着至关重要的作用。除了捕获和杀死细菌外，NETs活性成分也可以中和毒力因子。例如，NETs中大量的组蛋白通过增强细菌膜的通透性促进抗微生物肽形成膜孔，并阻碍细菌膜修复，从而使其具有抗菌特性[31-32]。此外，来自福氏志贺菌的侵袭性质粒抗原IpaB和IcsA(用于细胞-细胞扩散)可被NE降解[33-34]。现已证实，NETs可在体外有效降解细菌，包括许多与呼吸系统增殖和感染相关的细菌，如铜绿假单胞菌[35]、肺炎链球菌[36]、金黄色葡萄球菌[7]、嗜血杆菌[37]、组A链球菌[38]和大肠埃希菌[39]。在早期肺炎球菌肺炎小鼠肺泡中，也可观察到NETs。更重要的是，NETs捕获细菌的能力减弱了细菌从上呼吸道向下呼吸道的迁移，降低了细菌扩散到血液中的可能性[40]。由此可见，NETs有助于防御细菌性呼吸道感染。

3.1.2抗真菌作用 与NETs抗菌功能相比，目前对NETs在真菌感染中作用的认识尚浅。Urban等[41]报道称，钙卫蛋白作为NETs中的主要抗真菌成分，参与宿主防御白色念珠菌。钙卫蛋白是中性粒细胞中最突出的胞质蛋白，约占所有胞质蛋白的50%，它通过螯合二价金属离子抑制真菌的生长[42]。因此推测，钙卫蛋白是防御真菌感染的有效成分。实验证明，在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶缺乏导致的慢性肉芽肿病中，中性粒细胞不能在肺中形成网状结构以应对烟曲霉菌性肺炎[43]。故认为，NETs能增强宿主抗真菌能力。

3.1.3抗病毒作用 尽管细菌和真菌因粒径较大不能穿过NETs而被捕获，小病毒粒子理论上可以逃离诱捕网的包围。但有研究指出，体外NETs捕获病毒能够降低宿主细胞的感染性，表明NETs有助于防御病毒性疾病的传播[44]。如最典型的婴幼儿严重下呼吸道感染的病原体——呼吸道合胞病毒可诱导Toll样受体4依赖的NETs。NETs能够捕获呼吸道合胞病毒，从而减弱病毒颗粒与靶细胞的结合并防止感染[45]。除了简单地捕获病毒粒子外，NETs还具有直接的抗病毒活性[46]。从NETs中捕获的病毒颗粒表现出较低的传染性，NETs的这种直接抗病毒作用可能通过暴露出网中的颗粒蛋白(如MPO和防御素)而介导[47]。

3.2NETs对呼吸道的损伤作用 NETs在呼吸道的宿主防御中具有潜在的有益抗病性功能，当出现广泛、失衡的中性粒细胞招募和激活时，中性粒细胞的保护作用很容易转向损伤作用，并导致严重的呼吸道疾病。

3.2.1NETs与急性肺损伤(acute lung injury，ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS) ALI是由多种诱因引起的以急性、进行性呼吸功能不全为特点的一种常见临床危重症，严重时表现为ARDS，即由各种非心源性内外致病因素(如严重感染、创伤、休克、吸入有害气体、中毒)导致的急性、进行性、缺氧性呼吸功能不全或衰竭[48]。ALI/ARDS是由于直接或间接的过度肺部损伤和全身性炎症反应所致，其中NETs发挥重要作用[49]。在ALI/ARDS急性期，激活的肺泡巨噬细胞分化为具有促炎作用的M1表型。M1型巨噬细胞释放有毒物质(如一氧化氮、超氧化物和基质金属蛋白)破坏组织，同时M1型巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子-α和γ干扰素也会激活中性粒细胞，中性粒细胞在ARDS的急性炎症反应过程中产生NETs[50]。

NETs上布满了蛋白质复合物，这些蛋白质黏附在气道上，加重了肺部损伤。Wan等[51]研究表明，网状结构的形成可能导致体外肺上皮和内皮细胞的死亡，表明网状结构对肺泡-毛细血管屏障有直接的毒性作用。在金黄色葡萄球菌诱导的ALI小鼠模型中，肺泡上皮细胞以及毛细血管中均存在网状结构[52]。在机械性通气引起的肺损伤以及输血相关性的ALI动物模型中，网状结构广泛存在于肺微血管内[53-54]。因此，NETs对呼吸道和肺部的间接损伤可能在呼吸系统疾病中发挥作用。

3.2.2NETs与气道阻塞 除直接损伤肺组织外，NETs的形成也会导致更多的间接并发症。富含DNA和蛋白质的黏液所致气道阻塞是许多慢性呼吸系统疾病[如囊性纤维化、哮喘和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)]的病理特征之一。研究证实，慢性呼吸系统疾病的黏液栓主要来源于中性粒细胞，以DNA、NE、MPO、Cith3蛋白复合物以及其他中性粒细胞蛋白复合体的方式沉积在NETs中，而NETs中的高水平DNA可以增强黏液的黏弹性，导致气道阻塞和细菌繁殖[55-57]。当调节跨气道上皮层的碳酸氢盐和氯化物分泌平衡的囊性纤维化跨膜转导调节因子的功能被破坏时，囊性纤维化患者的中性粒细胞凋亡延迟，这种细胞凋亡延迟使囊性纤维化中性粒细胞能更有效地形成NETs[58]。NETs的过度形成促使肺泡中的黏液变得黏稠，进而促使细菌(如流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌以及大量铜绿假单胞菌)的定植[59]。这种定植促进了NETs的中性粒细胞的浸润，使痰液黏度增加，从而降低患者的呼吸能力。

CXC趋化因子受体2是一种G蛋白偶联受体，它以高亲和力结合CXC趋化因子配体，如CXC趋化因子配体8/白细胞介素-8。CXC趋化因子配体8/白细胞介素-8被认为是COPD气道分泌物中吸引中性粒细胞的主要趋化因子[60]。此外，当COPD病情加重时，中性粒细胞上调并与CXC趋化因子及其互补受体结合，特别是CXC趋化因子受体1/2，从而在气道黏膜中激活和募集[61]。同时CXC趋化因子受体2信号转导参与调节COPD中性粒细胞的NETs的产生。CXC趋化因子受体2阻断剂AZD5069能够限制COPD患者离体血液和痰中NETs的形成[62]。另有研究表明，呼吸道合胞病毒通过磷脂酰肌醇-3-激酶和核因子κB信号转导系统激活中性粒细胞，并抑制抗氧化酶的表达，引起气道黏膜炎症和细胞氧化损伤[63-64]。除上述机制外，融合蛋白F通过激活Toll样受体4信号转导联级反应诱导活性氧类的产生及胞外信号调节激酶和p38促分裂原活化的蛋白激酶的磷酸化反应，释放MPO和NE包裹的NETs[65]。NETs与脱落的上皮细胞和大量中性粒细胞共定位于密集的细胞栓塞中，从而引起气道阻塞[45]。在融合蛋白F刺激下，DNA纤维上表达的NE和MPO通过破坏结缔组织，降解内皮细胞基质硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，加重肺部呼吸道合胞病毒感染，导致感染后组织损伤[66]。由此可见，在慢性呼吸系统疾病中，NETs参与了一些特征性病理表现的形成，如蛋白堆积使分泌物变得厚重而黏稠，影响肺换气功能，从而诱发或加重感染。

3.2.3NETs与结核病 结核病是由结核分枝杆菌引起的主要侵袭肺部的慢性传染病，患病率和病死率较高[67]。通常进入肺部的病菌能够被肺泡巨噬细胞吞噬并杀死，但结核分枝杆菌能够在巨噬细胞内生存。在结核分枝杆菌感染早期，炎症细胞被募集到肺部，并抑制结核分枝杆菌生长，此时结核分枝杆菌感染发展为潜伏性感染，肺实质肉芽肿的形成保证了芽孢杆菌与宿主防御的平衡。当机体免疫力降低时，机体的免疫反应不能抑制结核分枝杆菌生长，肉芽肿病变增加，潜伏性结核发展为活动性结核[68]。有证据表明，中性粒细胞是结核分枝杆菌感染后最早迁移至局部组织中的细胞，也是肺结核患者气道中最丰富的白细胞[69]。在早期肉芽肿形成期，中性粒细胞被迅速募集到受感染的肺部，成为结核分枝杆菌的宿主[70]。当中性粒细胞受到两种结核分枝杆菌基因型(H37Rv和M.canetti)的刺激时，中性粒细胞释放嵌有NE和组蛋白的NETs[71]。NETs仅能捕获结核分枝杆菌，但不能杀死结核分枝杆菌，这可能加重结核病的肺部损伤。另有研究发现，结核分枝杆菌分泌的早期分泌性抗原靶6 kDa蛋白诱导结核分枝杆菌从吞噬体逃逸到细胞质，并诱导NETs的形成[72]。中性粒细胞在活动性结核病患者肺肉芽肿中释放高水平的钙卫蛋白[73]，该蛋白是NETs的组成成分之一[41]。中性粒细胞释放的钙卫蛋白与NETs的结合不受限制。由此可见，结核分枝杆菌诱导的NETs加重了结核病患者的肺部损伤。

4 小 结

呼吸道感染作为常见的临床疾病，其疾病进程与预后一直是临床研究的焦点，但目前针对NETs在呼吸道中作用的研究较少。NETs可作为有益的抗微生物诱捕网起作用，但过度形成的NETs不仅未对疾病进程起到缓解作用，反而加重了组织损伤。此外，NETs参与抑制和杀灭黏膜上皮组织的病原微生物，但其相关作用及机制尚不明确，尤其是对呼吸道中鼻黏膜组织的研究非常有限，且上呼吸道NETs大量形成的原因仍需深入研究。因此，寻找NETs保护性和不良反应性之间的平衡点有助于未来探寻呼吸系统疾病防治的新疗法。