利用POE策略进行基于真实科研情境的PCR实验教学*

付 鑫 （北京市十一学校 北京 100039）

POE教学模式是20世纪90年代初由White R.T.与Gunstone R.F.基于概念转变理论和人本建构主义理论提出的课程组织形式。该教学模式将课程分为预测（predict）、观察（observe）和解释（explain）3 个阶段，往往借助实验为教学内容背景，引导学生根据前科学概念预测实验结果、观察真实实验现象、利用学科知识解释实验现象，实现错误概念的转化，建立科学的生物学概念［1］。通过对课程内容进行合理的POE 教学设计，同时渗透生物学科学研究的思想方法，培养学生的实验探究能力，充分尊重了学生的认识发展规律［2］。

在分子水平的生物学研究中，PCR（聚合酶链式反应）是最常用的技术之一。新课标的“教学提示”明确提出了“利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA 片段并完成电泳鉴定”的要求。在基因工程等微观领域的生物学研究与实践中，PCR 实现了扩增目的基因及更为广泛的应用。选取载脂蛋白E（ApoE）和软骨寡聚基质蛋白（COMP）2 个代谢相关蛋白基因的功能研究为背景，融入基因敲除技术，带领学生通过预测、观察和解释等环节，通过PCR实验对敲除小鼠的基因型进行检测，实现遗传学、基因工程等高中生物学概念的综合运用。在实验中，学生有机会像科学家一样明确研究问题、设计实验方案、分析实验结果，实现2017年修订版生物学课程标准提出的“教学过程重实践”的课程理念。

1 建立研究情境

教师以学案的方式展示研究情境，带领学生通过小组讨论的方式分析基因敲除的原理和小鼠遗传杂交的后代基因型，确定本节课实验的主题——用PCR 鉴定敲除小鼠杂交后代的基因型。

载脂蛋白E 能帮助胆固醇在血液中转运，该基因表达异常会造成小鼠血浆中总胆固醇和甘油三酯浓度异常升高，造成高血脂。通过基因定位，研究人员确定该基因位于小鼠7 号染色体上［3］。软骨寡聚基质蛋白基因位于小鼠8 号染色体上，该基因在软骨细胞中表达量较高，表达异常会导致软骨发育不全，常用于骨代谢研究［4］。

1.1 获得单基因敲除嵌合体小鼠 哺乳动物的基因敲除经常利用同源重组原理实现［5］（图1）。根据待敲除基因的序列设计1 段含有插入序列和标记基因的同源DNA 片段，将其与运载体连接构建出重组DNA 分子，并利用显微注射或电转染等方法导入小鼠胚胎干细胞。由于重组DNA 分子上具有待敲除基因的同源序列，在重组酶的作用下，同源片段将会替换受体细胞中的野生型基因，从而实现单基因敲除。将经过上述处理的干细胞注入野生型小鼠早期胚胎，培养成为小鼠个体，由于发育过程包含基因敲除的干细胞及野生型小鼠胚胎细胞2 个来源，因此，将其称为单基因敲除“嵌合体”小鼠。

图1 获得基因敲除嵌合体小鼠的操作步骤［5］

1.2 获得单基因敲除纯合子小鼠 利用嵌合体小鼠与野生型小鼠进行杂交，F1代小鼠中将包括单基因敲除杂合子和野生型2 种类型。由于同源DNA 片段中含有的标记基因能影响小鼠毛色，因此，可通过表型对F1小鼠进行鉴定。将鉴定出的杂合子小鼠相互杂交，F2代小鼠中将出现野生型、单基因敲除杂合子和单基因敲除纯合子3 种类型，由于敲除基因为隐性，预测杂合子表现为野生型性状（图2）。

图2 由基因敲除嵌合体小鼠获得敲除纯合子小鼠的操作步骤［6］

1.3 利用PCR 的方法筛选双基因敲除小鼠 为获得双基因敲除小鼠用于代谢研究，将上述ApoE、COMP单基因敲除小鼠多代杂交，获得子代小鼠。由于单基因敲除小鼠中包含纯合子、杂合子，子代小鼠可能出现野生型、单敲除和双敲除等不同类型。这些小鼠很难从表型直接判断出基因型，需要从分子水平通过比较野生型基因与带有插入序列的同源片段的结构差异，利用PCR 的方法鉴定出双基因敲除纯合子小鼠［6］。

2 实验教学流程

2.1 提出问题并预测 在学生通过阅读，了解研究情境之后，教师需要引导学生明确本实验的核心问题：如何利用PCR 技术测定基因型？学生可通过小组讨论，用绘制实验方案流程图的方式明确实验思路（图3）。

图3 实验方案流程图

为达成实验目的，学生需要解决3 个关键问题：①如何设计区分目的基因与敲除基因的特异性引物？②杂交后代小鼠有哪些可能的基因型？③PCR 产物的电泳结果可能产生哪些条带，如何通过电泳条带推测对应小鼠的基因型？针对这些问题，教师可通过便携电子设备播放视频及同伴启发等方式帮助学生梳理PCR 与电泳技术的基本原理，并引导学生重新研读情境中的信息，帮助学生区别野生型基因与敲除基因结构的差异，正确设计PCR 的特异性引物（图4），并预测小鼠DNA样本PCR 产物的电泳结果。

图4 PCR 的引物设计

学生的错误概念往往集中在对基因敲除效果的预测及小鼠杂交实验结果的分析。第1，学生由于没有正确理解基因敲除过程中以干细胞为敲除受体的意义，会对研究情境中“嵌合体”的概念产生疑问，将其等同于敲除“杂合子”；第2，学生无法意识到敲除的结果只能改变1 对等位基因中的1 个，对F1代产生“杂合子”而非敲除“纯合子”产生疑问。第3，研究为获得双敲除小鼠，将2 种单基因敲除小鼠进行多代杂交，学生不能清晰地利用自由组合定律分析这一双因子杂交实验结果。这些错误概念都可能导致学生产生错误的预测，此时教师不必急于纠正学生的错误，而是引导小组学生根据各自的分析思路大胆预测，并收集所有成员的预测结果，以期在实验过后“解释”环节对错误概念的转化。

2.2 进行实验并观察 教师指导学生按照如下步骤进行实验：1）配制PCR 体系：根据表1所示，利用微量移液器按照从多到少的顺序，依次在25 μL 的PCR 管中加入PCR Mixture、ddH2O、DNA模板和3 种引物，于500 r／min 离心5 min 混匀；2）进行PCR：根据表2所示设置PCR 程序，将PCR样品至于PCR 仪中，开启程序；3）制备电泳胶：称取1.5 g 琼脂糖溶于100 mL 1×TAE 电泳缓冲液中，在微波炉中加热熔化，待凝固前加入5 μL GoldView荧光染料，混匀导入电泳胶模具，冷却凝固；4）电泳并观察结果：待PCR 完成，取4 μL 产物，加入1 μL 6×上样缓冲液在封口膜上混合均匀，加入到凝胶孔中，每块凝胶选择1 条泳道加入3 μL DNA Marker，100 V 电压下电泳20～30 min，利用紫外线凝胶成像仪进行观察。

表1 ApoE 与COMP 基因的PCR 体系

表2 ApoE 与COMP 基因的PCR 程序

本实验可采用快速PCR 试剂盒，教师在课前对试剂进行预处理，提前将DNA 聚合酶、含Mg2+的PCR 体系缓冲液、dNTPs 混合，形成PCR Mixture，指导学生根据说明在25 μL 的PCR 管中构建PCR 体系。在学生动手操作之前，教师需对微量移液器的使用进行培训，确保PCR 体系中各种试剂的含量准确。

2.3 分析结果并解释 教师将凝胶成像仪检测结果进行汇总，展现给全班学生（图5），结果先由小组进行讨论分析，确定条带位置，若条带明显则分析小鼠样本基因型及表型，条带不明显或位置异常则进行归因分析（表3）。

图5 学生实验结果示例

表3 学生实验结果分析

在此过程中，学生首先结合电泳成像结果，比较野生型基因与敲除基因的片段长度差异，分析电泳结果对应的小鼠基因型（图6）。学生利用这一结果，重新对基因敲除过程和杂交实验进行回顾和分析，在互相启发和教师的引导下，对“预测”阶段产生的错误概念进行转化。第1，基于同源重组的基因敲除发生在干细胞中，能将干细胞中野生型等位基因中的1 个替换，形成杂合子。将杂合子干细胞导入野生型小鼠胚胎，发育形成的小鼠个体中存在2 种基因型（野生型和单基因敲除杂合子的细胞），因此称为“嵌合体”。第2，为获得单基因敲除纯合子小鼠，研究人员将嵌合体小鼠与野生型小鼠杂交，F1代小鼠将会出现野生型和单基因敲除杂合子2 种类型，将杂合子小鼠杂交后才能获得单基因敲除纯合子。第3，根据研究情境所述，ApoE基因和COMP基因位于不同的染色体上，符合自由组合定律。利用2 种单基因敲除小鼠进行多代杂交，每对基因独立遗传，在子代中会出现野生型、单基因敲除杂合子、单基因敲除纯合子3 种类型，只有敲除纯合子表现为高血脂、软骨病等异常性状。利用图6的分析结果，分别判断来源于同一只小鼠样本2 个基因的基因型，可筛选出双基因敲除纯合子小鼠。在形成正确的科学概念和分析思路后，学生能通过实验结果推测小鼠样本的基因型和表型（表3），从而解决本实验的核心问题，达成研究目标。

图6 电泳结果对应的基因型分析

通过对实验结果的分析，部分学生实验结果不佳，主要原因包括PCR 体系构建有误造成非特异性扩增、电泳电压过大造成拖尾严重、电泳时间过短造成条带分离不佳等。

解释阶段是对预测阶段的回应，同时也是对实验操作、观察阶段的检验。在预测阶段产生错误概念的学生会发现真实的实验结果无法与自己的预测相吻合，在小组合作与教师引导之下，他们会追根溯源，从研究情境的理解、基因敲除和PCR技术的原理、遗传分析的方法等角度发现并转化自己的错误概念，形成科学的实验探究思路及相关概念。由于学生的接触微观实验的机会很少，在操作过程中存在不少失误，给实验带来误差，通过对实验结果的科学分析，对误差进行归因，是提升学生解决实际问题的能力、培养批判性思维的良好途径。

3 教学反思

本实验通过建立真实的科研情境，将高中生物学教材中“照方抓药”的体验式实验改造成为具有实践性和综合性的探究性实验。在实验过程中，学生有机会像科学家一样设计实验思路、预测实验结果、解释实验现象、进行误差分析、形成实验结论。一方面对高中生物学有关遗传和生物技术相关概念进行了整合，另一方面培养学生运用科学思维方法认识事物、解决实际问题的科学思维和科学探究能力，落实了核心素养。POE 教学策略在明确研究核心问题的基础上，充分发挥学生的主动性，以学生的预测为开端，经过实验、观察、结果分析与解释，让学生在实践过程中发现、转化自己的错误概念，形成科学的知识与思维体系。由于实验中选取的小鼠样本未知，因此，不一定真实得到双敲除小鼠，这也反映了科学研究的真实性，引导学生尊重实验事实的科研精神。