胡蔓藤内生真菌分离鉴定及抗菌活性研究*

王 嫚 吴智楠 周天赐 李佩琪 刘春梅 周 迪 林 洁**

（1 江苏第二师范学院生命科学与化学化工学院，江苏省生物功能分子重点实验室 江苏南京 210013 2 华东师范大学生命科学学院，上海市调控生物学重点实验室 上海 200241）

人们已从天然产物中发现了具有各种生物活性的化合物，包括镇痛药物阿司匹林、抗癌药物紫杉醇和长春新碱等，目前，已上市的小分子新药化学实体中有63%源自天然产物。而微生物因其数量大、种类多，成为药物研发的优质材料。其中从药用植物中分离得到的内生真菌，往往能产生不同于常规环境中的生存策略，其代谢或防御系统常常特别发达，成为药物发现的优质来源，能产生结构类型多、结构新颖、活性广泛的次生代谢产物。我国已发现3 万多种高等植物，其中药用植物11 000 多种，而研究过内生真菌的药用植物仅有21 科44 属62种2 变种，相对于我国丰富的药用植物资源，内生真菌活性及化学成分的研究还远远不够。因此，药用植物内生真菌极具研究价值。

胡蔓藤又名钩吻，是马钱科（Loganiaceae）胡蔓藤属（Gelsemium）植物，因其剧毒性而闻名。该属植物目前世界上共发现3 种，分别为分布于美洲国家［1-3］的常绿钩吻（G.sempervirensArt.）、沼泽茉莉（G.rankiniiSmall.）及主要分布在我国福建、广西等南部地区和东南亚地区的胡蔓藤（G.elegansBenth.）。胡蔓藤植物为常绿木质藤本，小枝呈圆柱形，幼时具纵棱；叶片为膜质，形状多为卵形、卵状长圆形或卵状披针形；苞片边缘和花梗除幼时被毛外，全株均无毛；种子呈扁压状椭圆形或肾形，边缘具有不规则齿裂状膜质翅。胡蔓藤属植物一般5—11月开花，7月至翌年3月结果。多生于海拔500～2 000 m 山地路旁灌木丛中或潮湿肥沃的丘陵山坡疏林下［4］。我国胡蔓藤的研究历史悠久，《本草纲目》中对于胡蔓藤的描述为“主金疮、乳痈、中恶风、咳逆上气，鬼痊蛊毒”。我国民间因其毒性大，一直以外用为主，能祛风、消肿拔毒、杀虫止痒；而对猪反而有驱虫、止喘、镇静、催肥和免疫作用，因此，民间称其“人的毒药，猪的人参”［5］。20世纪60年代，在福建闽南地区有民众用胡蔓藤烧灰干粉口服治疗胃癌和肝癌，均取得一定疗效，其药理活性开始引起关注。1930年左右，研究人员对胡蔓藤先后进行了毒理和药理学、生物学、化学等研究［1］。药理活性显示，胡蔓藤具有免疫、镇痛、促造血、抗心律失常、抗炎和禽畜复壮等多种活性，对肝癌细胞（Bel-7402 和HepG2）、肺癌细胞（A549）、结肠癌细胞（HGC-27）和宫颈癌细胞（Hela）具有明显的抑制增殖作用［6］。

调查统计表明，至今研究者已从胡蔓藤属植物中分离出生物碱、萜类和甾体等成分，而该属植物最为人广知的主要成分是其中的生物碱。研究者从该属植物中共分离得到50 余种生物碱，根据其的结构特点分为六大类：萨杷晋碱Sarpagine型、钩吻素子Koumine 型、胡蔓藤碱乙Humantenine 型、11-去甲氧基钩吻素乙Gelsedine 型、钩吻素甲Gelsemine 型、育亨烷Yohimbane 型。这些生物碱在结构上都含有一个吲哚或氧化吲哚母核结构，具有多个手性中心和复杂的笼状结构［1，6-7］。

2015年Liu 等［8］首次从胡蔓藤内生真菌Guignardia mangiferae中发现3 个倍半萜和1 个聚酮类新结构化合物，与胡蔓藤植物中的多种生物碱的药理活性类似，均对脂多糖诱导的BV2 细胞炎性反应有强抑制作用（IC50：4.2～15.2 μmol／L）。除此之外，未见其他有关胡蔓藤内生真菌研究的报道。本实验以药用植物胡蔓藤为实验材料，对其内生真菌进行分离纯化，通过形态学和分子生物学方法对其进行种属鉴定，并系统性地分析了胡蔓藤植物根、茎、叶和花这4 个部位中内生真菌的多样性，并以革兰氏阳性细菌代表金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和革兰氏阴性细菌代表大肠杆菌Escherichia coli.为指示菌，通过纸片法进行抑菌活性测试，该研究丰富了药用植物胡蔓藤内生真菌资源，并为进一步开发利用胡蔓藤内生真菌资源提供参考依据［9-10］。

1 材料

1.1 仪器与试剂

仪器：超净工作台（苏州净化设备有限公司）、高压灭菌锅（南京博惠科学仪器有限公司）、恒温培养箱（上海鸿都电子科技有限公司）、PCR 扩增仪（Biorad）、台式超速离心机（上海三发科学仪器有限公司）、三恒多用电泳仪（北京市六一仪器厂）。

试剂：75%乙醇、次氯酸钠溶液、DNA Marker（DL 2000）、50×TAE、电泳缓冲液、2×PCR Master-Mix、引物ITS4 和ITS5、Loading Buffer、核酸染料。

1.2 植物材料 植物样品采集自广西的新鲜胡蔓藤植株，选择其根、茎、叶、花4 个部位进行实验。经暨南大学高昊教授鉴定为胡蔓藤。

1.3 培养基

1）分离纯化培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：46.0 g PDA 粉末溶于1 L 蒸馏水中，边加热边搅拌至其完全溶解，混匀后，121℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却备用。

2）抑菌培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：称取3.0 g 牛肉膏、10.0 g 蛋白胨、5.0 g NaCl，置于1 L蒸馏水中，并加入20 g 琼脂粉，搅拌均匀，并将pH 值调至7.4～7.6，121℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却备用。

3）营养肉汤液体培养基：称取18 g 营养肉汤干粉置于1 L 蒸馏水中，搅拌均匀，121℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却备用。

1.4 供试菌种 测试菌株为采购自上海鲁微科技有限公司的大肠杆菌（ATCC25922）及金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］。

2 实验方法

2.1 分离纯化内生真菌 使用蒸馏水将胡蔓藤植物表面污垢冲洗干净。将根、茎、叶、花进行粗剪。在超净工作台中进行植物组织表面的消毒（用75%的乙醇浸泡30 s；无菌水漂洗3 次，每次1 min；用次氯酸钠浸泡1 min；再次用无菌水漂洗3 次，每次1 min），最后用无菌滤纸吸干表面水分备用［11］。为检测材料表面灭菌的效果是否彻底，将最后一次漂洗组织的无菌水，取适量涂布于PDA 培养基上，28℃培养1 d。培养基表面无菌落长出，则代表灭菌彻底。将表面彻底灭菌的根、茎、叶、花在超净工作台用无菌刀片切割成0.5 cm×0.5 cm 的小块。用无菌镊子将其分别平铺于PDA 固体培养基平板上，28℃培养至样品边缘菌丝长出，之后反复挑取菌丝，直至最终获得纯种菌株，并将其转接到PDA 斜面，待其长满斜面，保存至4℃冰箱备用［12-13］。

2.2 内生真菌形态学鉴定 将固体培养基制成平板，以点植法进行接种，即用接种针尖挑取菌丝尖端点植于PDA 平板的中心，然后于25～28℃避光培养一定时间（通常为7～10 d）进行观察，大小以菌落的直径（mm）表示。观察的要点包括：菌落的颜色、菌落表面的纹饰、菌落的质地、菌落的高度、菌落边缘、是否有渗出物等，并进行记录。取一小段细致不粗糙且粘性好的胶带，从菌落表面的中心向边缘粘，用浓度为75%的乙醇进行固定，选择乳酸石炭酸棉蓝染色液，对其进行染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于显微镜下观察产孢结构等特征，参考《真菌鉴别手册》进行鉴别［14］。

2.3 分子生物学方法鉴定内生真菌 首先进行胡蔓藤内生真菌的基因组DNA 提取，将其作为PCR 扩增模板。真菌DNA 的提取采用CTAB 法（cetyltriethylammonium bromide，十六烷基三乙基溴化铵）［15］。

利用PCR 技术对所提取的真菌rDNA ITS 区进行扩增，选用的引物为ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。反应条件设置为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃复性30s，72℃延伸45 s，30 个循环，最后72℃延伸5 min。

将扩增产物电泳凝胶置于凝胶成像仪中，在紫外光下观察条带位置。将确定扩增成功的扩增产物送至上海生工生物有限公司，进行测序。所得到的序列进入NCBI 数据库，通过BLAST 搜索相似性的序列，并将这些序列相似性高的菌株序列，用 软 件ClustalX 1.8 进行多序列比对分析［9，16］，再将这些相似的序列导入软件MEGA5.10 中进行同源性分析，从而构建系统发育树（算法：Neighbor-Joining，进化距离计算模型：Kimura 2，置信度检测：bootstrap，自展次数：1 000 次）［17-18］。

2.4 内生真菌多样性指数的计算 内生真菌群落的多样性分析主要采用Shannon-Weiner 公式：H′=－∑PilnPi，其中Pi代表胡蔓藤中某种内生真菌分离得到的数量占总真菌数量的百分比［9］。

2.5 内生真菌抗菌性筛选 在无菌的操作环境下，用接菌环挑取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为测验菌株，接种至营养肉汤液体培养基，放置于摇床中35℃，200 r／min 转速培养5 d。将普通滤纸片用打孔器打成直径为6 mm 的圆形滤纸片，放置于培养皿中，121℃高压蒸汽灭菌20 min 备用［19］。用移液器分别吸取200 μL 菌悬液至牛肉膏蛋白胨培养基上，用涂布棒涂布均匀。配制好100 mg／mL 菌提取物的萃取液，分别吸取5 μL液体转接至6 mm 的圆形滤纸片上制成药敏片自然晾干。用无菌镊子夹取制备好的药敏片平贴于含菌平板上，每组3 个重复，28℃培养24 h，测量抑菌圈大小。选择100 mg／mL 青霉素钠与恩诺沙星溶液作为该实验的阳性对照［20］。

3 实验结果与分析

3.1 内生真菌鉴定结果 从新鲜采取胡蔓藤的根、茎、叶和花中分离纯化得到60 株菌株，从宏观菌落形态及显微形态（图1）鉴定并去重后，获得30 株不同菌株。对此30 株菌种进行分子生物学鉴定（表1），共17 个种，来自于7 目、7 科、9 属。60 株内生真菌中，在根中分离得到15 株内生真菌，占总菌株数的25%，鉴定为4 属、5 个种，分别为木霉属Trichoderma spirale，节菱孢属Arthriniumsp.、Arthrinium saccharicola，枝孢属Cladosporiumsp.，链格孢属Alternaria alternat。茎中分离得到26株内生真菌，占总菌株数的43%，鉴定为7 属、11个种，包括间座壳属Diaporthe eres，刺盘孢属Colletotrichum gloeosporioides，节菱孢属Arthrinium saccharicola，枝孢属Cladosporiumsp.，链格孢属Alternaria alternata、Alternaria burnsii、Alternaria brassicicola、Alternariasp.YXM4，平脐蠕孢属Bipolaris setariae，青霉属Penicillium citrinum、Penicilliumsp.YL201。叶中分离得到18 株内生真菌，占总菌株数的30%，鉴定为5 属、7 个种，分别为刺盘孢属Colletotrichum siamense、Colletotrichum gloeosporioides，小丛壳属Glomerellasp.R207，节菱孢属Arthrinium saccharicola，枝孢属Cladosporiumsp.，链格孢属Alternaria alternata、Alternariasp.YXM4。花中分离得到1 株内生真菌，占总菌株数的2%，鉴定为间座壳属Diaporthesp.。链格孢属Alternaria的菌株共有18 株，占总菌株数的30%，节菱孢属Arthrinium有12 株，占总菌株数的20%，这2 个属内生真菌为胡蔓藤优势属内生真菌。计算胡蔓藤根、茎、叶、花中内生真菌多样性指数分别为1.494、2.266、1.798、0。茎明显高于根、叶、花。其中，根、茎和叶中均存在的菌株为枝孢属Cladosporiumsp.、互生链格孢Alternaria alternata，仅存在于根中的内生真菌为木霉属Trichoderma spirale，节菱孢属Arthriniumsp.、Arthrinium arundinis，仅存在于茎中的内生真菌有间座壳属Diaporthe eres，链格孢属Alternaria burnsii、Alternaria brassicicola，平脐蠕孢属Bipolaris setariae，青霉属Penicillium citrinum、Penicilliumsp.YL201，仅在叶中分离得到的内生真菌为刺盘孢属Colletotrichum siamense、小丛壳属Glomerellasp.R207，仅在花中分离得到的内生真菌为间座壳属Diaporthesp.（表2）。

表1 胡蔓藤内生真菌ITS 序列鉴定结果

表2 胡蔓藤不同部位不同内生真菌数量

图1 内生真菌WM-11 菌落形态及显微形态图

3.2 内生真菌抗菌性结果 在鉴定出的17 种胡蔓藤内生真菌中，能对金黄色葡萄球菌产生抗性的菌株有14 种，占内生真菌总数的82%，能对大肠杆菌产生抗性的菌株有12 种，约占内生真菌总数的71%（表3）。抗金黄色葡萄球菌的阳性对照抑菌直径为（36.57±0.05）mm，抗大肠杆菌的阳性对照抑菌直径为（33.03±0.37）mm。相比于对照组，胡蔓藤内生真菌中，对金黄色葡萄球菌抑菌效果显著的有WM-12（Alternaria burnsii）抑菌直径为（21.53±0.39）mm、WM-3（Colletotrichum siamense）抑菌直径为（19.43±0.33）mm、WM-14（Alternariasp.YXM4）抑菌直径为（16.60±0.04）mm。对大肠杆菌抑菌效果显著的有WM-14（Alternariasp.YXM4）抑菌直径为（17.83±0.24）mm、WM-3（Colletotrichum siamense）抑菌直径为（14.03±0.12）mm。对2 种指示菌都有抑制效果的共有11 种，占总菌种数的65%（表3、图2）。

表3 胡蔓藤内生真菌抗菌活性

图2 胡蔓藤内生真菌抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌活性对比图（均值±标准误）

4 讨论

图3 抑菌效果

本实验从胡蔓藤根、茎、叶和花中分离纯化得到60 株菌种，共17 个种，来自于7 目、7 科、9属，包括间座壳属、刺盘孢属、小丛壳属、木霉属、节菱孢属、枝孢属、链格孢属、平脐蠕孢属和青霉属，其中，链格孢属与节菱孢属为优势属。在分离得到的胡蔓藤内生真菌中，对金黄色葡萄球菌起抗性的菌株有14 种，约占内生真菌总数的82%，对大肠杆菌起抗性的菌株有12 种，约占内生真菌总数的71%，此研究结果表明来自于新鲜的胡蔓藤植物体内的内生真菌活性较强，并且存在许多迫切需要开发的有价值的化学成分。在本实验分离得到的17 种真菌中，间座壳属、刺盘孢属、小丛壳属、节菱孢属、枝孢属、链格孢属、平脐蠕孢属中多为植物病原菌，而木霉属的真菌可寄生于多种植物病原菌。胡蔓藤的真菌报道较少，本研究为胡蔓藤内生真菌的研究提供了实验基础。一直以来，胡蔓藤药理研究多集中在肿瘤细胞毒活性，对于其抗菌活性未曾报道。通过对来自于胡蔓藤植物体内的内生真菌抑菌性探究发现，对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌2 种指示菌均有抑制效果的菌株共有11 种，约占总菌种数的65%，这些有价值的内生真菌属于广谱抗菌活性菌种。内生真菌在其生活过程中，往往会产生和其宿主类似的化学成分，这也提示药用植物胡蔓藤具有抗菌活性的研究价值，值得进一步深入研究。