基于PCR技术扩增序列改造纤维素分解菌的教学设计

李 真 沈 璟

［对外经济贸易大学附属中学（北京市第九十四中学） 北京 100102］

高中生物学教学要求在真实情境中解决问题，培养学生的科学思维和科学探究能力，这要求教师在课程中向学生提供丰富的素材，包括实验素材和科研素材，以及生产实践中的具体应用，使学生既能运用知识解决问题，又能体会生物学科的价值。《普通高中生物学课程标准（2017年版）》，更强调学生的获得，课堂的活动要有互动性、趣味性，凸显学生的主体地位，有效提升课堂质量。

1 教材及学情分析

本节是拓展课程，内容涉及选修1 专题3 课题3 及专题5 课题2，具体包括：纤维素酶分解纤维素的原理、纤维素分解菌的初步筛选、PCR 的原理及应用。本节课以课题1 微生物的实验室培养、课题2微生物的分离与计数、PCR 为技术基础，以必修1的酶的作用和特点及必修2 的DNA 复制为理解的前提，又与选修3 现代生物科技专题紧密联系。

学生具备酶的作用及特点的基础知识，了解纤维素酶分解纤维素和PCR 的原理，但知识不够系统化，尚不能前后联系；通过亲身的实验操作，初步掌握PCR 技术，但对于如何设计PCR 引物获得目的基因仍有一定困难，尤其是如何设计引物、改造DNA 片段；观察到了日常生活中的现象，例如，落叶的分解、植食性动物对植物的消化，但不能将其与所学知识相联系，并应用于生活、生产中。

2 教学目标

1）通过制备临时装片，在显微镜下观察并比较破壁机、土壤中初步分离鉴定的纤维素分解菌、纤维素酶的破壁效果，从定性的角度明确纤维素酶的破壁效果最好，形成初步的实验设想：利用生物技术对纤维素分解菌进行改造。

2）通过资料分析，了解原核生物和真核生物在表达纤维素酶方面的优、缺点，讨论得出实验设计，通过PCR 引物设计构建重组纤维素酶基因片段在原核生物中表达，培养与他人合作的意识及运用生物学术语叙述实验方案的能力，培养科学思维。

3）通过分析真实的工业生产中纤维素酶转化酵母菌的实例，体会生物学研究在生产实践中的应用，感悟生物科学研究的价值。

3 重、难点及突破方法

1）重点：①明确实验设计的一般思路和原则，单一变量、设置对照组；②描述实验结果、概述实验结论；③搭桥PCR 的引物设计。

2）难点：设计PCR 的引物获得重组基因片段（搭桥PCR）。

3）突破方法：以实验引入，激发学生兴趣，通过展示不同处理后的实验结果引起学生思考，分析实验采用的单一变量（自变量）是处理的方式不同，因变量是破壁的效果，请学生描述实验结果，说出实验结论。为了高效获得纤维素，最佳方法是酶解法，纤维素酶的制备选用什么方式更合理？出示大量的已有研究资料后，学生能提出采用细菌生产高效、经济，需要解决的问题是要加入一段序列才能使纤维素酶向胞外分泌，从而引出本节课的难点，将2段序列拼接，需要通过PCR 的引物设计，人为创造重叠区域体外扩增。通过小组讨论的形式，逐步引导学生加深思维力度；通过展示、纠错、改正的过程，更高效地落实重点、突破难点。

4 教学过程

4.1 纤维素的重要性 纤维素 （C6H10O5）n是由葡萄糖组成的大分子多糖，是地球上最丰富的可再生资源。纤维素主要来源于植物界，包括棉花、木材、种植业废弃物和禾草类植物，除了植物界，细菌和动物也可制造纤维素。据报道，每年全球大概会产生干重为1.3×1017t 的陆生植物，其中，纤维素占所有植物干重的50%。植物材料的主要成分除了半纤维素和木质素以外，就是纤维素，纤维素物质占地球总生物量的40%。若能将这些纤维素水解转化为具有经济潜力的生物多糖，不仅有利于环境保护，还可解决能源、粮食、环境等一些列问题［1］。提问：如何获取植物细胞壁中的纤维素？

4.2 纤维素的获取和结果分析 在教师引导下，结合生活经验和前期筛选纤维素分解菌的经历，学生提出可用物理（破壁机）、生物（纤维素分解菌、纤维素酶）方法破除细胞壁，获得纤维素或将其水解。随后，以小组为单位制备临时装片（图1），观察实验结果，学生能得出结论：采用纤维素酶处理，水解最彻底、效果最佳，而用纤维素分解菌处理在相同时间内效果不佳，所以，利用植物中的纤维素需要提纯获得纤维酶。

图1 不同处理后植物细胞情况

4.3 通过PCR 改造纤维素基因

资料1：纤维素是一种复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，Reese 等（1950年）曾提出了C1-Cx 假说，该假说认为组成纤维素的不同酶需要协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖。一般情况下，C1酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成Cx所需的新的游离末端，然后由CX酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由β-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖［2］。

纤维素酶的来源非常广泛，植物、昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌、真菌等都能产生纤维素酶，但是植物中的纤维素酶含量极低且难以提取，故目前纤维素酶的主要来源是微生物。

细菌培养周期短，抗污染能力强，成本相对低，但其产生纤维素酶的量相对较低，且大多不能分泌至细菌细胞外；主要产生的是C1酶，只有极少数细菌能分泌Cx 酶。真菌能产生3 类纤维素酶，但是分泌至菌体外的比例也较少,且会相互发生强烈的协同作用，酶的糖基化程度过高,还会影响酶的效率［3］。

任务：列举细菌、真菌生产纤维素酶的优、缺点（表1）。

表1 细菌、真菌生产纤维素酶的优、缺点

为了提高产量、节约成本，应同时生产出3 种酶使其能协同发挥作用，学生提出设想将真菌编码纤维素酶的基因转入细菌体内表达，可提高产量节约成本、优势互补，但这样操作仍存在问题，即细菌产生的纤维素酶不向胞外分泌。

资料2：酵母表达系统具有将纤维素的最终产物——葡萄糖转化为酒精的能力，如果能将纤维素酶的基因克隆至酵母中，可实现从纤维素到葡萄糖再到酒精的完整发酵过程。科研人员将瑞氏木霉纤维素基因（C1酶和Cx 酶）转入酿酒酵母中表达，离心后取上清液，检测重组酵母相对滤纸的酶活性，结果如图2所示［4］。

图2 重组酵母的相对滤纸酶活性

通过对资料2 的分析，学生能说出实验结果：2组的相对滤纸酶活性高于对照组（1 组），3、4 组的相对滤纸酶活性显著低于对照组，而3 组的相对滤纸酶活性又高于4 组。归纳实验结论：C1酶和Cx 酶共转化能提高相对滤纸酶活，3 组菌株中表达的Cx 酶很可能并未分泌至细胞外。

资料3：科研人员发现枯草芽孢杆菌也可产生纤维素C1酶。与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌具有以下优势：①在培养基中直接分泌蛋白并具有很强的分泌能力；②拥有一套高效分泌的信号肽系统，可高效地分泌目的蛋白；③是非致病性菌，无内毒素，具有临床和环境方面的安全性。

枯草芽孢杆菌的强分泌能力与信号肽序列相关，位于信号肽序列下游的基因片段，表达的蛋白质可分泌至细胞外［3］（图3）。

图3 枯草芽孢杆菌信号肽序列［3］

任务：①利用PCR 技术应选择引物________扩增枯草芽孢杆菌信号肽序列（表2）。

表2 引物名称及序列

②根据资料2 和资料3 提供的信息，请你提出提高原料利用率且降低成本酿酒的方法。

通过上述活动，学生能选择正确引物扩增目的基因片段，同时能提出需要将2 个片段相连接，人为设计一段中间重叠的区域，通过搭桥PCR 将信号肽片段和纤维素酶基因片段相连接。选择2个小组进行展示汇报，将最终结果（图4）呈现在黑板上，完善过程中其他小组提出质疑或答疑。

图4 引物设计及PCR 扩增过程

4.4 板书设计（图5）

图5 板书设计

5 教学反思

本节课的设计将实验和教学挂钩，引导学生发现问题、解决思路，形成良好的科学思维，将前期的纤维素分解菌的分离和鉴定实验与后续的PCR 实验相串联，巧妙衔接前、后知识。资料充分，既有学生的实验结果，也有科研的数据，提高学生的参与感，充分落实了对学生生物学学科核心素养的培养，在基本知识的基础上，培养学生的能力。整个课堂的呈现，学生参与度较高，教学设计对学生的思维训练由浅入深，能满足高阶思维的要求。课堂反馈环节，教师指出本节课是针对现有问题提出的设想，在真实场景中能否实现还有待进一步的研究和科学的论证，这些都是学生在未来科研中可研究的方面。