上尿路尿路上皮癌肿瘤细胞中细胞周期蛋白p14的表达及其临床意义

鲍正清，方 冬，杨新宇，何 群，李学松，周利群，满立波

(1.北京积水潭医院泌尿外科，北京 100035；2.北京大学第一医院泌尿外科，北京大学泌尿外科研究所，国家泌尿、男性生殖系统肿瘤研究中心，北京 100034)

上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma，UTUC)发病率较低，在西方国家，其年发病率约为1～2/10万，仅占所有尿路上皮癌的5%～10%[1-2]。根治性肾输尿管全长(radical nephroureterectomy，RNU)联合膀胱袖状切除是其标准的治疗方式[3]，然而，在手术治疗时，60%的患者出现局部进展，70%的患者为高级别肿瘤患者[4-5]。既往研究报道UTUC患者5年肿瘤特异性生存率(cancer-specific survival，CSS)为50%～80%。尽管肿瘤分期、分级、淋巴结状态、淋巴血管浸润(lymphovescular invasion，LVI)等预后指标被认为是预测UTUC进展和复发的最重要因素，但UTUC的生物学基础尚不完全清楚。细胞周期调控蛋白在肿瘤细胞分裂、肿瘤生长和进展中起着重要作用[8]。细胞周期蛋白p14作为肿瘤抑制蛋白参与p53通路，已被发现在许多人类癌症的发展中发挥重要作用，包括膀胱癌[9-10]。虽然p14的生物学特性已被广泛研究，但其在UTUC中的调控作用和临床意义尚不清楚，而UTUC与膀胱癌有许多相似之处，但因其是不常见的尿路上皮癌，可能与膀胱尿路上皮癌不同[11]。本研究旨在探究p14蛋白在UTUC中的表达及其与患者临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 患者的选择和评估回顾性收集了2006年1月至2013年12月间在北京大学第一医院经组织学确诊并接受手术治疗的657例连续性UTUC患者的资料。排除标准：①缺失随访信息(58例)；②合并膀胱癌(94例)或其他恶性肿瘤(13例)；③接受非RNU治疗(121例)；④最大肿瘤直径≤15 mm(97例)。最终纳入341例患者。对术前影像学或术中观察发现肿大淋巴结的患者行常规淋巴结清扫术。根据国际肿瘤控制联盟(Union for International Cancer Control，UICC)TNM分级指南(2002版)进行分期评估，根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO) 2004版分级系统进行分级。采用改良的中国患者肾小球滤过率方程计算估计的肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR) [eGFR (mL·min-1·1.73 m-2)=175×血肌酐-1.234×年龄-0.179(女性×0.79)][12]。术前肾功能状态判定标准：无慢性肾病 (eGFR≥60)、早期慢性肾病(60>eGFR≥15)和末期慢性肾病 (eGFR<15)[12]。

所有患者术后前3年每3个月行膀胱镜检查，随后每年1次膀胱镜检查。同时行胸片、尿细胞学检查、血清肌酐及腹部超声/计算机断层扫描(computed tomography,CT)/磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)检查。最后1次随访时根据检查结果确定肿瘤无病生存(disease-free survival，DFS)、CSS和膀胱内无复发生存(intravesical recurrence free survival，IVRFS)。

1.2 免疫组化采用标准免疫组化方法检测p14的表达。对多灶性肿瘤，选取最大的肿瘤标本进行免疫组化分析。基于前期实验，切片用p14抗体 (ab3642， 1∶2 000，Abcam plc， Cambridge，UK)4 ℃孵育过夜，然后与山羊抗兔IgG/HRP聚合物(PV-9001，ZSGB-BIO，北京)室温孵育20 min。

染色的组织切片由2位独立的泌尿科病理医师(杨新宇和何群)根据免疫组织化学评分系统(German Immunoreactive Score)进行评分，通过多方一致的回顾调查和分析。总分12分，为免疫反应细胞百分比得分(0分：0%～5%；1分：6%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%)与染色强度得分(0分：阴性；1分：弱染色；2分：中度染色；3分：强染色)乘积，结果判定：阴性(-,0～1分)，弱阳性(+，2～4分)，中度阳性(++，6～8分)，强阳性(+++，9～12分)。将p14表达定义为+～+++。

1.3 统计学分析所得数据采用SPSS 22.0 (IBM Corp，Armonk，NY，USA)进行统计学分析，P<0.05被认定为差异具有统计学意义，组间比较时，计数资料采用Pearson检验和卡方检验，连续变量采用Mann-WhitneyU检验。采用Kaplan-Meier法进行生存分析。单因素分析采用Log-rank检验，多因素分析采用Cox比例风险回归模型。只有在单因素分析中确定为显著的变量才纳入多因素分析。

2 结 果

2.1 患者特征341例患者有190例男性和151例女性，手术时中位年龄为69(29～86)岁，术后中位随访为51(7～123)个月。该队列患者包括208例肾盂肿瘤、93例低级别尿路上皮癌、248例高级别尿路上皮癌、124例非肌层浸润性肿瘤(pTa或pT1)、217例肌层浸润性肿瘤(pT2～4)、314例pN0肿瘤、3例pM1肿瘤和34例LVI肿瘤。合并鳞状分化为45例，腺样分化为18例，肉瘤样分化为22例。此外，39例患者有马兜铃酸暴露史。

2.2 p14表达与UTUC患者临床病理的关系147例 (43.1%)患者肿瘤组织p14表达阳性(图1)。如表1所示p14表达阳性与肿瘤多灶性(P=0.010)、肾盂位置(P=0.013)、病理T分期较低(P=0.001)、肿瘤分级较低(P<0.001)、无淋巴结转移(P<0.001)、乳头状肿瘤(P=0.001)、无鳞状分化(P=0.017)有关。

表1 p14表达与患者临床病理特征的关系 [例(%)]

A：p14表达阳性(阳性染色以细胞核为主)；B：p14表达阴性。

2.3 p14表达的预后意义在随访期间，109例患者死亡，其中97例死于UTUC相关因素。82例(24%)患者术后出现膀胱内复发，13例(3.8%)患者出现局部复发，8例(2.35%)患者出现对侧UTUC。Kaplan-Meier分析显示p14表达阴性与较短的CSS (P=0.022)、DFS (P<0.001)和IVRFS (P=0.028)相关(图 2)。

如表2所示，在Cox比例风险回归模型中，调整过患者性别、肿瘤分期、肿瘤分级、区域淋巴结状态、LVI、肿瘤结构、腺样分化、肉瘤样分化和马兜铃酸暴露史，p14表达阳性是CSS的独立预测因素(HR=0.596，95%CI:0.381～0.934，P=0.024)。调整过患者性别、年龄、肿瘤分级、区域淋巴结状态和LVI，p14表达阳性是DFS的独立预测因素(HR=0.555，95%CI:0.395～0.778，P=0.001)。调整过患者性别、多灶性、输尿管镜检和区域淋巴结状态，p14表达阳性是IVRFS的独立预测因素(HR=0.527，95%CI:0.317～0.876，P=0.014)。

表2 p14表达阳性与UTUC患者CSS、DFS和IVRFS的相关性分析

A：CSS；B：DFS；C：IVRFS。

3 讨 论

细胞周期蛋白p14表达与UTUC患者的临床病理特征和肿瘤预后相关的研究尚鲜见报道。本研究结果表明，p14表达与多灶性(P=0.010)、肾盂位置(P=0.013)、低病理T分期(P=0.001)、低肿瘤分级(P<0.001)、淋巴结转移(P<0.001)、乳头状肿瘤(P=0.001)、鳞状分化(P=0.017)等重要临床病理特征相关，p14表达阳性是CSS的独立预测因素(HR=0.596，95%CI:0.381～0.934，P=0.024)， DFS(HR=0.555，95%CI:0.395～0.778，P=0.001)和IVRFS (HR=0.527，95%CI：0.317～0.876，P=0.014)，这些可能帮助临床医生进行UTUC患者危险分层以提供更好的个体化的辅助治疗。

p14基因被认为是一种多功能基因，参与了细胞凋亡、细胞周期等多种生理过程[13-14]。当组织增殖时，为了抑制组织增生p14表达增加[15]。而在肿瘤进展过程中p14的表达水平是降低还是升高仍不清楚。有研究表明，p14在多种实体瘤中广泛下调，包括胰腺癌、食管癌、乳腺癌和膀胱癌[16-17]。相反，也有研究表明p14在某些肿瘤中表达上调[18]。我们的研究表明p14的表达与病理T分期和肿瘤分级呈负相关。此外，p14表达阳性的患者具有更好的生存率和更低的膀胱内复发风险，这与在喉癌和人类头颈部鳞状细胞癌中的研究一致[19-20]。导致表达改变的可能机制是由于基因组丢失、启动子高甲基化和表观遗传抑制[21-22]。然而，乳腺癌中p14表达的增加与疾病复发风险的增加和较差的生存结局相关[23]。既往关于膀胱癌的研究表明，p14 mRNA在正常尿路上皮和82%的浅表(Ta～T1)肿瘤中少量表达，而高水平的p14 mRNA主要表达在晚期和分级的肿瘤中[10]，p14+/p53-膀胱癌患者的生存期明显短于其他p14/p53表达类型的患者。该矛盾的发现可能与p14的双重功能有关，p14在某些肿瘤中起肿瘤抑制作用，但在其他肿瘤中具有致癌性，这也证明了UTUC是一种罕见的尿路上皮癌类型，可能与膀胱癌不同[11，25]。

本文是首个全国范围内的大样本UTUC患者队列中调查p14表达及其临床意义的研究。通过进行初步试验，我们优化了免疫组化方案，从而确保了方案的可靠性和可重复性。本研究的结果将有助于研究p14在肿瘤进程中的作用以及未来的靶向治疗。但是该研究存在一些缺陷，首先该研究仅涉及p14单个指标，若增加对p14相关联蛋白的研究，如p53和鼠双微体基因2(murine double minute 2，MDM2)等，则更能说明致癌过程为多因素共同作用。其次，本研究仅为单个中心数据的回顾性研究，可能存在选择性和回忆偏倚，纳入国内多中心数据可使结果更具有说服力，且UTUC患者存在种族差异，因此需要进一步来自非中国队列的验证。另外，本研究的准确性受到单一免疫组化方法的影响，其他技术(如逆转录-聚合酶链反应或基因测序等)可提高本研究的意义。最后，入组患者的肿瘤大小均不小于15 mm，以保证肿瘤组织样本足以进行免疫组化，这可能造成选择偏倚。因此在今后的研究中，我们将增加研究指标，纳入多中心数据，采用多种检测方法，并进行相关细胞学实验和动物实验以进一步阐明p14在UTUC发生发展中的作用。

综上，UTUC中p14表达下调与肿瘤侵袭性生物学特征相关，p14表达阳性的UTUC患者往往具有更好的CSS、DFS和IVRFS。然而，我们的研究结果仍需要进一步的验证并探讨其相关的分子机制。