食品检测用副溶血性弧菌标准物质的制备和评价

刘娜，赵琳娜，王学硕，崔生辉

（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐细菌[1]，主要污染海产品，如贝类、海鱼、海虾等均是常见的被污染物，甚至高盐腌制的食品如咸菜、腌肉等也能分离出副溶血性弧菌。海鲜盛产的夏秋季节，是由于食用被副溶血性弧菌污染食物而引起的食物中毒事件[2-4]的高发时段。随着人民生活水平的提高以及渔业的发展，现在人们四季均可以食用到各色海鲜，而由副溶血性弧菌导致的食物中毒事件也在国内外多地逐年发生[5-9]，水产食品的安全问题引起各国高度重视。

副溶血性弧菌检验是保证水产食品安全中的关键环节[10]。我国目前副溶血性弧菌检验依照GB 4789.9-2016进行检验，整个检验流程一般需要5～7个工作日；且在检验过程中有很多因素会干扰检验结果，如人员操作、培养基质量、检验环境等，排除外在干扰条件确保准确是立足之本，进一步提高时效性则是保证纷繁多样水产食品安全的重要措施。近年来，耐药菌株的出现[11,12]更对副溶血性弧菌检验的准确性和时效性更是提出了更高的要求[13-19]。而即用型副溶血性弧菌标准物质既能排除干扰保证结果，又能省去培养阳性对照菌株时间从而保证时效性。

我国在即用型微生物标准物质研究方面起步较晚[20]，关于副溶血性弧菌的标准物质，目前只有福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心研究含有鱼肉基质副溶血性弧菌标准物质[21]的报道，而不含基质的标准物质目前还没有相关报道，且国外目前尚无副溶血性弧菌的标准物质的相关报道。本研究制备的副溶血性弧菌标准物质不含基质，可以依据不同目的添加不同基质或直接使用，灵活性更高。弥补了我国在副溶血性弧菌标准物质方面的不足。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，V. parahaemolyticus）CMCC20030来源于中国医学细菌保藏管理中心（China Medical Bacterial Species Conservation and Management Center，CMCC）。

1.1.2 试剂与仪器

3%氯化钠碱性蛋白胨水、TCBS培养基为北京陆桥公司产品；胰蛋白胨大豆琼脂（tryptose soya agar，TSA）为美国BD公司产品；生理盐水、氯化钠、L型细胞涂布棒（L棒）为国药集团产品；西林瓶（2 mL）为肖特药品包装（浙江）有限公司。Thermo1389生物安全柜为美国Thermo公司产品；Thermo 205050GC恒温培养箱为美国Thermo公司产品；VITEK COMPACT 2全自动微生物分析系统为产品法国梅里埃公司；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）为德国Bruker公司产品；LABCONCO FreeZone12L冷冻干燥机为德国LABCONCO公司产品；FORMA恒温摇床、HYC-940螺旋涂布仪为西班牙IUL公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株确认

用10 μm接种环，取冻存于-80 ℃冻存液（50%甘油配制的BHI液体培养基）的CMCC20030菌株一环，分区划线于3%氯化钠TSA平板，置36 ℃培养18～24 h。挑取单菌落分区划线于3%氯化钠TSA平板，置36 ℃培养18～24 h。分别采用质谱（MALDI-TOF MS）、生化方法（VITEK COMPACT 2全自动微生物分析系统）、基因序列（16S RNA）测定3种方法对CMCC20030菌株进行种属确认。

1.2.2 副溶血性弧菌样品的制备

用高压灭菌后的棉签收集CMCC20030新鲜培养物于冻干保护剂中，涡旋震荡确保菌液均匀，以20 μL/样品进行速冻，于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，制备样品。

用1 mL生理盐水稀释冻干前菌液20 μL，通过螺旋涂布仪的E50模式涂布于3%氯化钠TSA平板，置36 ℃培养18～24 h后，计数活菌数目作为冻干前样品CFU数目。用1 mL生理盐水溶解样品，并依照上述方法涂布、培养，统计菌落数作为冻干后样品CFU数目。冻干前样品CFU数目/冻干后样品CFU数目为冻干存活率。依照冻干存活率调制菌液，最终制备成103CFU/样品的副溶血性弧菌菌球800个，将每个样品分别放入2 mL的西林瓶中，并用冷冻干燥机真空压盖，待用。

1.2.3 副溶血性弧菌样品的均匀性检验

随机抽取副溶血性弧菌样品20个，依照检测冻干后样品CFU数目的方法，设置2个平行，统计样品CFU数目。通过单因素方差分析方法分析本次研制的副溶血性弧菌样品的均匀性。

1.2.4 副溶血性弧菌样品的稳定性检验

将副溶血性弧菌样品放置于25、37 ℃环境中，分别于1、3、5、7 d抽取3个样品，依照均匀性检验方法统计样品CFU数目，并以均匀性检验样品的均数为基数计算存活率，对运输稳定性进行评价。

将副溶血性弧菌样品放置于4 ℃、-20 ℃冰箱中，其中4 ℃保存的样品分别于0、7、14、28 d各抽取3个，-20 ℃保存的样品分别于14、28、60 d各抽取3个，分别依照均匀性检验方法统计CFU数目，并以均匀性检验样品的均数为基数计算存活率，对保藏稳定性进行评价。

1.2.5 协作标定

向5家实验室分别发放随机抽取的10个样品，并提供作业指导书。作业指导书提供方法如下：将每个样品溶解于1 mL生理盐水中，使用涡旋振荡器充分混匀作为原液，取100 μL原液与900 μL生理盐水混匀，制成1:10稀释液，分别取上述两种浓度的稀释液100 μL，并用L棒或全自动螺旋涂布仪涂布于3%氯化钠TSA平板，设置2个平行，将平板置36 ℃培养18～24 h后，统计样品CFU数目，并对菌落进行生化鉴定。

1.2.6 副溶血性弧菌菌球食品基质验证

表1 食品基质信息表Table 1 Food matrices information

根据GB 29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》选择水产制品作为食品基质（详见表1），称取每种基质2份（25 g/份），1份作为验证基质，1份作为本底对照。随机取3个样品用3 mL生理盐水溶解作为待验证菌液，取100 μL至各个验证基质作为试验组，另取100 μL生理盐水至本底作为对照组，随后依照GB 4789.7-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》进行检验。

1.2.7 数据处理

各个检测项目的数据均经SPSS（Statistical Product and Service Solutions）处理。

2 结果与讨论

2.1 菌株种属确认

菌株CMCC20030种属结果确认如下：MALDI-TOF MS鉴定为V. parahaemolyticus（分值为2.302），VITEK COMPACT 2全自动微生物分析系统鉴定为V. parahaemolyticus（99% Probobility），16s RNA基因序列经NCBI分析为V. parahaemolyticus（100% Percent Identity）。

2.2 副溶血性弧菌冻干样品的制备

本研究制备副溶血性弧菌冻干样品800个。在研制过程中发现，副溶血性弧菌冻干后存活率较低（0.8‰），这可能也是限制我国副溶血性弧菌标准物质发展的限制因素之一。本研究通过提高副溶血性弧菌母液的浓度以及优化冻干条件，如选择液氮快速塑形（样品为白色球状）、真空冻干以及真空压盖，已经形成了稳定的研制方法：制备高浓度（106CFU/mL）副溶血弧菌母液浓度，在液氮中快速塑形成球（20 μL/球）、真空冻干16 h、真空压盖、-20 ℃保存样品。

2.3 副溶血性弧菌冻干样品的均匀性检验

表2 副溶血性弧菌样品均匀性计数结果Table 2 Results of uniform count ofV. parahaemolyticussamples (103 CFU/sample)

表3 副溶血性弧菌样品运输稳定性计数结果Table 3 Counting results of transport stability ofV. parahaemolyticus samples (103 CFU/sample)

表4 副溶血性弧菌样品储藏稳定性试验结果Table 4 Counting results of preservation stability ofV. parahaemolyticus samples (103 CFU/sample)

随机抽取的20个副溶血性弧菌冻干样品计数结果见表2。经分析，数值分布符合正态分布，最大值为2490 CFU/样品，最小值为1950 CFU/样品，中位数为2320 CFU/样品，均值为2286 CFU/样品，样品间标准差约为330 CFU。经单因素方差分析，样品满足均匀性检验要求（F=1.92，p＞0.05）。从均匀性检验结果结果看出，拿到样品后，用1 mL生理盐水溶解本样品即可得到103CFU/mL的菌溶液（微生物检验适于定性、定量的工作液），省去稀释等过程。

2.4 副溶血性弧菌样品的稳定性检验

副溶血性弧菌样品运输稳定性检验结果见表3。从结果可以看出，在37 ℃存放3 d或25 ℃存放7 d后样品活菌数目仍满足研制前设定的103CFU/菌球要求。

副溶血性弧菌样品保藏稳定性检验结果见表4。从结果可以看出，-20 ℃保藏60 d或4 ℃保藏28 d后样品活菌数目仍满足研制前设定的103CFU/菌球要求，即-20 ℃可以作为长期存放条件，且经过后期继续监测，发现-20 ℃保藏3年后仍为103CFU/菌球。而4 ℃可以作为短期储存条件。

在稳定性检验中，发现副溶血性弧菌标准物质在37 ℃存放3 d内，样品满足103CFU/菌球要求，而我国运输系统较为发达，样品寄送时间大约2～3 d，因此满足运输稳定性要求。若在邮寄时添加冰袋或干冰，则稳定性会进一步加强。如何提高副溶血性弧菌标准物质在37 ℃等高温条件下的稳定性是未来研究的方向。

2.5 副溶血性弧菌样品的协同标定

为保证研制的副溶血性弧菌样品数据准确可靠，本实验室组织了5家实验室开展协作标定实验。标定结果显示，生化鉴定均为副溶血性弧菌，具体活菌含量结果见表5。从结果可以看出，5家实验室检测样品活菌含量均在103CFU/样品的水平，满足研制前设计含量为103CFU/样品的要求。

表5 5家实验室协作标定结果(103 CFU/样品)Table 5 Collaborative calibration results of 5 laboratories

本实验室关于副溶血性弧菌标准物质计数的方法均是螺旋涂布方法。如在均匀性检验中，各个样品活菌含量数值高度一致，样品间误差小。而在组织协同标定的实验中，有些实验室选择手工L棒涂布的方法，虽然结果都满足103CFU/样品要求，但是样品间差异大于螺旋涂布的方法。可能原因是在螺旋涂布时，仅有涂布针孔接触样品溶液以及培养基，且针孔涂布路径一致。而L棒涂布时，接触培养基的面积远大于涂布针孔；且涂布路径不能保证高度一致，另外在涂布完成后沾留在L棒上的菌液也存在差异，以上因素均可能导致偏差。现在国内外不少定量研究均是采取螺旋涂布接种方法[22,23]。

2.6 副溶血性弧菌样品的食品基质验证

在食品基质验证实验中，试验组均检测出副溶血性弧菌，结果见表1；对照组均未检测出副溶血性弧菌。

为保证副溶血性弧菌样品具有广泛的应用范围，本研究根据GB 29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》选择20种水产制品作为食品基质做验证试验。通过结果可以看出，本研究副溶血性弧菌标准物质可以直接作为对照适用于多种水产质品副溶血性弧菌检验中的阳性对照，省去接种、培养阳性对照菌株的时间，简化检验程序，提高检验效率。

3 结论

本研究研制的副溶血性弧菌标准物质均一性、稳定性以及基质验证均符合预期设定，满足相关要求，已被纳入国家药品标准物质（编号800006）。副溶血性弧菌标准物质不仅可以用于加强对食品副溶血性弧菌检验的质量控制，还可以用于实验室内部培养基质量、阳性对照、方法确认、人员考核、检验环境等各个环节的质量控制，而且本研究制备的副溶血性弧菌标准物质不含基质，可以依据不同目的添加不同基质或直接使用，灵活性更高，为今后准确无误的副溶血性弧菌检验提供基础支持，更是弥补了我国在副溶血性弧菌标准物质方面的不足。