基质分散固相萃取结合气相色谱串联质谱法 快速筛查皂角米中的73种农药残留

张权，周贻兵，林野，李磊，吴玉田，刘文政，刘利亚，郭华，陈庆园

（贵州省疾病预防控制中心-实验中心，贵州贵阳 550004）

皂荚属（Gleditsia japonicavar. delavayi）系豆科苏木亚科，约12种，主要分布于亚洲、美洲、热带非洲。中国原产8种，引进1种，主要分布于河南、山东、贵州、云南等地[1,2]。皂荚是皂荚属中唯一能食用种子外胚乳的种，其外胚乳俗称皂角米，又叫雪莲子、皂角仁、皂角精等。而贵州多产双荚皂角米，该品种颗粒饱满，呈天然淡黄色，煮后口感软糯，具有补肾、润肺、明目、提神补气之功效[3,4]。由于近年来人们对绿色健康食品的崇尚，“物以稀为贵”的皂角米也价格倍增，某些地区把种植皂角米作为一项脱贫致富的产业，鼓励农民扩大种植面积，其发展前景可观。而目前皂角米的农药残留问题报道较少，同时相关部门也未发布皂角米相关产品的质量检验标准。由此可见，建立一种准确、快速、成本低廉的皂角米中多种农药残留确证分析方法具有重要意义。

世界上常用农药有千余种之多，每种农药的性质又是千差万别，这些都给农残的筛查和准确定量带来一定的困难。而样品前处理更是农药残留检测的关键，占整个分析过程2/3的时间[5,6]。目前样品前处理方法正朝着简单化、节约化和微型化发展[7-9]。而基质分散固相萃取法（Dispersive solid phase extraction，dSPE）是近几年在QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）基础上发展起来的新型样品前处理方法。相比固相萃取法（Solid phase extraction，SPE）[10]、凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，GPC）[11]等传统方法，dSPE法是将萃取和净化于一体，具有操作简单，高效，无需特殊设备和有机溶剂用量少等优点[12,13]，特别适合批量样品检测，在时间效率、净化效果等方面都优于传统方法。其次，皂角米中农残检测大多数是参照食品安全国家标准GB23200.9-2016《粮谷中475种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》，而皂角米与其他粮食作物最大的区别是其含有丰富的植物胶质，当按照该标准进行样品前处理操作时，样品提取液经旋蒸浓缩后呈胶状，无法进行后续的净化操作，所以该标准处理方法不适用于皂角米基质。同时，气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）比气相色谱（GC）和气相色谱-质谱（GC-MS）更适合农残检测，这是由于GC-MS/MS采用二级MS离子定性，既可排除假阳性，又可提高检测灵敏度和准确性[14-16]。

本研究结合皂角米种植中经常喷洒的农药种类，选择有机氯、有机磷、菊酯、氨基甲酸酯等73种代表性农药作为目标分析化合物，其中涵盖GB 2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》在粮食中明确禁止在国内销售和使用的25种杀虫剂及杀菌剂，以及糙米中有农药限量要求的指标。通过优化提取溶剂、dSPE萃取管及纯化管的类型及用量，建立dSPE结合GC-MS/MS快速测定皂角米中多种农药残留的快速筛查方法，为日后在食品风险监测领域对粮食中农药残留的筛查和确证、风险评估、定量仲裁等研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

33种药典中农药定制混标，天津阿尔塔科技有限公司；10种氨基甲酸酯混合标准溶液，农业部环境保护科研监测所；16种有机磷混合标准溶液，SB05-069-2008，农业部环境保护科研监测所；7种菊酯混标，100 μg/mL，美国O2si公司；其余16种农药标准品均购自于农业部环境保护科研监测所；乙腈、丙酮，色谱纯，美国TEDIA公司；CNW dSPE萃取包及纯化管，上海安谱实验科技股份有限公司；内标：环氧七氯（GSB 05-2317-2016，100 μg/mL），农业部环境保护科研监测所；皂角米样品采集于贵州织金县、纳雍县、余庆县、修文县。

1.2 仪器设备

布鲁克Scion-TQ三重四级杆质谱联用仪，美国BRUKER公司；SWLF-200多功能涡轮粉碎机，郑州旭朗机电设备有限公司；高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 标准储备液的配制

分别吸取农药标准溶液各1 mL混匀，合并后体积为20 mL，配制成混合标准溶液，-4 ℃保存，待用。

1.4 样品处理过程及实验优化过程

1.4.1 样品处理过程

选取500 g以上代表性样品，利用大功率涡轮粉粹机粉碎后置于自封袋中。准确称取4.00 g试样于50 mL离心管中，加入10 mL 1%乙酸乙腈涡旋振荡2 min，超声提取15 min，然后加入萃取包（填料为6 g硫酸镁及1.5 g醋酸钠），涡旋振荡1 min，10000 r/min 离心5 min，准确吸取上清液1 mL加入到纯化管中，加入内标40 μL，涡旋振荡1 min，10000 r/min离心5 min，上清液过0.22 μm滤膜后用于上机测定。

1.4.2 实验优化过程

提取液考察实验：本研究选取数份经GC-MS/MS验证无目标物的皂角米空白样品，分别添加50 μL不同质量浓度的混合标准使用液，通过考察1%乙酸乙腈、乙腈、甲醇三种提取溶剂对73种目标化合物的提取效率的影响。

dSPE纯化管内用量优化实验：本研究选取数份经GC-MS/MS验证无目标物的皂角米空白样品，分别添加50 μL不同质量浓度的混合标准使用液，然后按照1.4.1样品前处理过程操作，在净化过程中分别考察GCB，PSA净化剂的不同用量（25 mg、50 mg、100 mg、150 mg、200 mg）对目标物提取回收率情况。

表1 73种农药保留时间及质谱条件参数Table 1 Retention times and GC-MS/MS conditions of the 73 pesticide

续表1

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱：Agilent J&W DB-1701MS石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气：氦气，纯度≥99.999%；分流模式：不分流进样，进样口温度：250 ℃，流速：1.0 mL/min，进样量：1.0 μL。程序升温条件：起始温度60 ℃，保持1.0 min，以40 /min℃升至120 ℃，再以5 /min℃升至280 ℃保持8.5 min，共43.0 min，溶剂延迟5.0 min。

1.5.2 质谱条件

电离模式：电子轰击离子化（EI）离子源，电离能量：70 eV，分析模式：质谱多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，离子源温度：230 ℃，传输线温度：280 ℃，碰撞气：氩气。

1.5.3 数据处理

采用仪器自带MS Workstation 8.0软件进行数据采集，通过全扫描模式获得目标物的保留时间，同时利用软件自带Factory Library数据库选择采集的目标物的离子对信息，对目标物进行准确的定性定量分析。

2 结果与分析

2.1 萃取包及提取溶剂的选择

图1 三种提取溶剂的平均提取效率对比Fig.1 Comparison of average recovery rates of the three extraction solvents

QuEChERS方法是近年发展迅速的一种农药多组分残留检测前处理方法，但在最初的过程中是没有添加缓冲盐类物质的，这就可能导致某些对pH敏感的农药化合物产生一定的降解，而dSPE法首先加入萃取包，其填料为6 g硫酸镁及1.5 g醋酸钠，由于缓冲盐的加入，就会对某些农药的降解速度起到一定的减缓作用。其次，本研究选取数份经GC-MS/MS验证无目标物的皂角米空白样品，分别添加50 μL不同质量浓度的混合标准使用液，通过考察1%乙酸乙腈、乙腈、甲醇三种提取溶剂对73种目标化合物的提取效率的影响，结果如图1所示。从图中可以看出，与甲醇相比，乙腈的溶剂性能较好，对大部分化合物的提取效率较高，对色素、脂肪等非极性成分的提取能力较弱，尤其是经酸化处理的乙腈进行提取后，更适宜萃取极性范围较宽的多种农药，结果表明；73种化合物提取的平均回收率为78.7%，其中回收率最低的为63.2%，可满足实验要求，所以本方法采用10 mL 1%乙酸乙腈为提取溶剂。

图2 GCB用量对目标物回收率的影响Fig.2 The effect of GCB dosage on target substance recovery

2.2 纯化管内净化剂用量的选择

dSPE法在灵敏度可以达到要求的情况下减少浓缩步骤，通过优化后的净化条件可以去除样品中的较多杂质及色素，净化效果较好，操作步骤较少。dSPE纯化管内填料的选择上要考虑基质的复杂程度，目前主要的净化剂主要有N-丙基乙二胺固相吸附剂（PSA）[17]，石墨化碳黑吸附剂（GCB）[18]，C18吸附剂[19]等，通常PSA去除脂肪酸等强极性杂质的效果较好，C18去除维生素、甾醇、油脂等非极性杂质的能力较好，无水硫酸镁去除水分和水溶性杂质的效果较好，GCB的脱色效果较好。

其次在dSPE纯化管内填料量也要充分考虑，虽然净化填料越多，净化效果越好，但过量的净化剂也会影响某些农药的回收率，所以本研究在净化过程中同时考察了GCB，PSA净化剂的不同用量（25 mg、50 mg、100 mg、150 mg、200 mg）对目标物回收率情况，结果如图2所示。从图中可以看出，当GCB含量为50 mg时，只有5个目标物的回收率在60%～65%，可以满足实验要求。而当GCB含量超过100 mg时，三唑磷、喹硫磷等9种农药的回收率会下降至60%以下，这就表明过量的GCB会对某些平面结构的农药吸附效果明显；其次PSA可利用-NH-H产生的氢键作用去除皂角米提取液中的糖、酸和某些极性基质，减少基质对进样系统的污染。实验中当GCB为50 mg时，将PSA用量从50 mg增加至250 mg，73种农药的加标回收率基本无影响。所以通过实验优化，在不同极性目标物的回收率满足方法要求的情况下最终确定纯化管内填料的规格为（150 mg MgSO4、50 mg PSA、50 mg GCB、50 mg C18）。在优化好的实验条件下，皂角米样品加标后的MRM总离子流图如图3所示。

同时，本研究中为进一步探究dSPE法的净化效果，分别称取两份同一皂角米样品，其中一份样品加入10 mL乙腈后超声提取10 min，上清液过0.22 μm滤膜后直接进样分析，另一份样品按照1.4.1样品前处理过程进行操作，分别在Full Scan模式条件下分析，样品未净化及经dSPE净化后的全扫谱图如图4所示，根据全扫谱图可以看出，针对皂角米基质经dSPE净化后的效果较好，能够去除大部分杂质，可满足准确定量的要求。

图3 皂角米基质加标样品在MRM模式下的总离子流图Fig.3 Total ion chromatogram in MRM mode of a seeds of Gleditsia sinensis matrix spiked sample

图4 未净化与dSPE净化后在全扫描模式下的总离子流图Fig.4 Total ion chromatogram in full scan mode of unpurified and dSPE cleaned

2.3 基质效应

质谱检测中首要考虑的就是基质效应问题，它会造成增强或抑制组分的信号响应，进而影响定量的准确性[20,21]，而且不同的浓度水平产生的基质效应程度也不同，通常基质效应的相对强度（ME）=（基质标准溶液的峰面积/溶剂标准溶液的峰面积）×100%，当ME的值为100%～120%，基质效应可忽略不计，当ME＞120%，表现为基质增强效应，最有效的办法就是使用基质标准曲线进行定量。本研究考察了73种农药的基质效应，分别按照1.4.1进行前处理操作，皂角米中目标农药的基质效果如图5所示。结果显示：dSPE法的ME范围为112%～173%，其中41种农药的ME＞120%，由此可见与液相色谱质谱联用不同的是，气相色谱串联质谱法的基质效应大多数以增强为主[22,23]。所以本研究为了减少基质效应对定量的影响而采用基质匹配标准曲线内标法定量。

图5 皂角米中目标农药的基质效果（MEs）Fig.5 Matrix effect (MEs) of target pesticides in seeds ofGleditsia sinensis

2.4 线性范围、检出限、定量限及加标回收率

在GC-MS/MS确证的实验条件下，取皂角米空白样品按样品制备处理后，得到空白提取液，分别加入6个不同浓度的混合标准溶液，在优化好的色谱条件和质谱条件下进行测定，以内标法定量。以待测物的定量离子对峰面积与内标物定量离子对峰面积之比为纵坐标，样品中待测物的质量浓度为横坐标绘制标准曲线。同时，采用皂角米空白样品中添加目标物的方法，以10倍信噪比（S/N）对应的质量浓度确定定量限（LOQ）。其次，取数份经GC-MS/MS验证无目标物的皂角米空白样品，分别添加100 μL不同质量浓度的混合标准溶液，按照上述优化后的方法进行样品前处理，并上机分析，平行测定6次，其回收率和相对标准偏差（relative standard deviations，RSD）如表2所示。

通过表2可以看出，73种目标物线性关系良好（R2＞0.99）。采用加标回收的方法确定方法定量限（LOQ，S/N=10）分在2.5～20.0 μg/kg，73种化合物加标回收率范围在68.6%～110.7%之间，RSD（n=6）在2.1%～9.7%之间，表明本方法重复性良好，可满足实际检测的需要。

表2 73种化合物线性方程、相关系数、方法定量限和加标回收率Table 2 Linear equations, correlation coefficients, limit of quantification (LOQ) and recovery of the 73 pesticides

续表2

图6 阳性样品中氯氟氰菊酯的MRM总离子流图Fig.6 MRM total ion chromatogram of cyhalothrin in positive sample

2.5 实际样品分析

采用本研究建立的方法对贵州织金县、纳雍县、余庆县、修文县采集的共80份样品中的73种目标农药进行监测，其中1份样品中检出氯氟氰菊酯残留，检出率为1.25%，检出的农药含量为0.021 mg/kg，其残留量均未超过国家标准及地方标准规定的最大残留限量值。这可能由于皂角本身有一定的生物活性[24,25]，如皂荚、荚果及枝刺具有除湿毒、杀虫功效，所以皂角也常用作绿色杀虫剂。图6为阳性样品中氯氟氰菊酯的MRM总离子流图。

3 结论

本研究针对现行国家标准中对皂角米特殊基质中净化条件的不足，以QuEChERS法为基础，建立并优化dSPE法结合GC-MS/MS快速测定皂角米中多种农药残留的快速筛查方法，该方法的前处理步骤简便，无需特殊设备，方法适用性强，净化效果较好，适合粮食基质中多组分农药残留的筛查和确证，方法的定量限也能够满足国内对农药残留的检测要求。