细胞穿膜肽与人表皮生长因子 在大肠杆菌中的重组融合表达

李风，柯博文，孙中伟，韩双艳

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东省发酵与酶工程重点实验室，广东广州 510006）

人表皮生长因子（human epidermal growth factor，hEGF）是一种单链小分子多肽，含53个氨基酸，相对分子质量为6.2 ku，6个半胱氨酸（Cys）在分了内形成3对二硫键，等电点为4.6[1]。EGF是由美国Vanderbit大学医学系Cohen教授[2]在1962年用羧甲基纤维素柱从小鼠颌下腺分离纯化神经生长因子（nerve growth factor，NGF）时偶然发现的小分子多肽，研究发现这种活性多肽不仅能对神经细胞有作用，而且与小鼠的眼睑早开和牙齿提早萌芽也有关联。1975年Cregory等[3]又从人尿液中提取出这种活性物质，并命名为人表皮生长因子（hEGF），又因其可抑制胃酸的分泌，又称抑尿胃素。EGF在人体各种组织和体液中都广泛存在，包括血液、乳汁、胃液和十二指肠中，调节多种生理生命活动，能够加速组织的增殖与分化，促进胚胎细胞的增殖与分化，影响器官的生长发育[4]；促进表皮细胞生长，对皮肤相关疾病具有一定的修复治疗价值等[5]；特别的，EGF对刺激性食物导致的胃肠溃疡有显著疗效，对促进胃肠粘膜的发育，参与受损粘膜的修复有着重要的作用[6]。

细胞穿膜肽（cell-penetrating peptide，CPP）是一类能携带大分子物质进入细胞内部的短肽，其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用[7]，已经实验证实的生物大分子有寡聚核苷酸、肽段、蛋白质、纳米颗粒和脂质体等[8]。穿膜肽重要的一个应用是能够作为载体携带多肽和蛋白质跨越肠道[9]、肺上皮[10]以及穿越血脑屏障[11]等；Park等[12]证实了TAT-SOD和9Lys-SOD（超氧化物歧化酶SOD）具有穿透表皮细胞的能力。Guo等[13]构建了重组基因TAT-hEGF-CD47（免疫球蛋白CD47），发现其能有效促进人皮肤成纤维细胞和皮肤上皮细胞增殖，促进作用与TAT-hEGF-CD47浓度呈正相关。给药至皮肤后，TAT-hEGF-CD47由于TAT结构域有效地穿透皮肤表皮层，并在皮肤中停留了很长时间，因为CD47片段通过单核吞噬系统减缓了其清除速度。国内对CPP（细胞穿膜肽）的研究也早已开始，梁英民等[14]将PTD（蛋白转导结构域）与慢性粒细胞白血病癌蛋白Bcr/Abl在大肠杆菌中融合表达，将纯化出的蛋白加入培养的HL60细胞和C2C12细胞后，发现PTD（蛋白转导结构域）可以介导Bcr/Abl蛋白跨膜进入细胞内。余婷玉等[15]成功创建了一种含有穿膜肽标记的荧光素酶（LUC）融合蛋白即TAT-LUC。与LUC相比，TAT-LUC能够穿透细胞膜进入细胞，并对ATP和肿瘤细胞具有更好的灵敏性。

天然EGF的来源十分有限，王武康等[16]利用8种分离工艺与2步柱层析，最终从40 L健康男性尿液中，制备出hEGF 2.36 mg。随着基因工程技术的兴起，已成功在不同的系统中表达出hEGF，包括大肠杆菌Escherichia coli（E. coli）[17]、豆科植物花生[18]、毕赤酵母Pichia pastoris（P. pastoris）[19]和家蚕[20]，逐渐满足hEGF的需求量。人表皮生长因子（hEGF）由于其在上皮细胞的生长和分裂中起着重要作用，在皮肤相关损伤和疾病中具有良好的应用前景；但其透膜效率低，以0.5 μg/g的剂量涂抹在皮肤12 h后累积透皮率仅有0.993%[21]；皮肤中的hEGF可以被单核吞噬细胞系统快速清除[22]，这些限制了它的应用。为了克服hEGF透皮率低，利用大肠杆菌异源表达易形成包涵体等，综合考虑人表皮生长因子hEGF表达形式和表达量，我们在hEGF的N端引入细胞穿膜肽Pep-1，再克隆至携带GST标签的表达载体PGEX-4T-1中，尝试提高表达量和增加蛋白的可溶性，以图提高hEGF的生产效率，并对目的蛋白进行了纯化，为hEGF的进一步开发利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

大肠杆菌BL21（DE3）和E.coli Top10’，由华南理工大学微生物酶学实验室保存。携带GST标签的表达质粒PGEX-4T-1，购自Invitrogen公司；质粒PUC57-epEGF，携带已经过大肠杆菌密码子优化后的目的基因epEGF（EK/Pep-1/G4S/hEGF融合片段），该融合基因片段由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.2 主要试剂和工具酶

限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ购自TaKaRa公司；KOD DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、PCR Mix和标准分子量蛋白质Marker购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；PCR纯化试剂盒购Magen（美基）生物有限公司；质粒小量制备试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；氨苄青霉素（Amp）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），生工生物工程（上海）有限公司；其余常用试剂均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

LB液体培养基（g/L）：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化钠；SOC液体培养基（g/L）：20 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、0.5 g氯化钠、KCl 0.186 g、MgCl20.39 g；2%葡萄糖；SOB液体培养基（g/L）：20 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、0.5 g氯化钠、KCl 0.186 g、MgCl20.39 g；2× YT液体培养基（g/L）：16 g胰蛋白胨、10 g酵母提取物、5 g氯化钠。TB液体培养基（g/L）：20 g胰蛋白胨、24 g酵母提取物、12.54 g K2HPO4、2.31 g KH2PO4、0.4%葡萄糖；LB固体培养基（g/L）：10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化钠、2 g琼脂糖，根据需要添加Ampicillin，终浓度为100 μg/mL。

1.1.4 仪器与设备

知楚恒温培养摇床，上海知楚仪表有限公司；PCR仪，德国Eppendorf公司；Eppendorf 5804R型高速冷冻台式离心机，德国Eppendorf公司；UV-2350型分光光度计，UNICO公司；AKTA蛋白纯化系统，美国通用电气公司；GST Focurose 4FF、Q Focurose 6HP预装柱，武汉汇研生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 穿膜肽Pep-1与人表皮生长因子hEGF融合基因的优化及合成

在NCBI数据库中获得人表皮生长因子hEGF蛋白序列（Sequence ID:2KV4_A）。将文献报道的Pep-1蛋白序列（KETWWWETWWTEWSQPKKKRKV）通过柔性肽（GGGGS）连接至hEGF片段的N端，并且在穿膜肽N端添加肠激酶酶切位点（DDDDDK），如图1所示。将该融合基因氨基酸序列送往合成，经大肠杆菌密码子优化而获得的碱基序列，全基因合成255 bp后克隆至质粒pUC57，得到含有穿膜肽与人表皮生长因子融合基因的重组质粒pUC57-epEGF。

图1 融合蛋白EK-Pep1-G4S-HEGF重组表达质粒的构建过程Fig.1 Construction of recombinant expression plasmid of fusion protein Ek-Pep1-G4S-hEGF

1.2.2 重组人表皮生长因子表达载体的构建与鉴定

在epEGF融合片段上下游分别引入BamH Ⅰ、XhoⅠ限制性酶切位点，设计引物，（引物序列：epEGF-F：GGCCGGATCCGATGATGATGATAAAA AAGAAACC；epEGF-R：ATACTCGAGTTAGCGC A GTTCCCAC）。以pUC57-epEGF为模板，进行PCR扩增。将PCR产物用PCR产物回收试剂盒纯化，用限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ对PCR回收产物及质粒PGEX-4T-1分别进行双酶切，纯化回收后用T4连接酶22 ℃进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌E. coli Top10感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR（引 物 序 列：epEGF菌 落PCRF：GCGCCGACATCA TAACGGTT，epEGF菌落PCR下引：CAGACAAGC TGTGACCGTC）。将阳性转化子培养过夜，提取质粒，然后进行BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切验证，之后重组质粒送生工生物工程（上海）有限公司测序。测序结果显示得到重组表达载体PGEX-4T-1-epEGF（缩写为pGST-epEGF）。将鉴定后的质粒转入E.coliBL21（DE3）感受态细胞表达，在LB氨苄青霉素抗性平板上挑取单菌落培养，提取质粒双酶切鉴定，将验证正确的菌种用于后续发酵。

1.2.3 目的蛋白的表达与SDS-PAGE分析

挑取鉴定正确的重组大肠杆菌BL21（DE3）-pGST-epEGF单菌落于10 mL含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37 ℃，220 r/min，培养12～16 h。将菌液按照1:100转接至100 mL的LB液体培养基（含100 μg/mL氨苄青霉素）中，37 ℃，220 r/min，继续培养到OD600为0.6～0.8时，加入1 mol/L的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1 mmol/L，16 ℃，200 r/min条件下继续诱导培养12 h。

将发酵液采用6600 r/min室温离心10 min，收集菌体，用蒸馏水将菌体洗涤两次后加入破碎缓冲液重悬菌体。在冰浴条件下超声破碎20 min（破碎条件：6 mm变幅杆，频率30%，超声3 s，间隔3 s）。对破碎后的全菌液采用10000 r/min，4 ℃，30 min冷冻离心，分离上清和沉淀，将获得的全菌液、上清、沉淀样品分别进行SDS-PAGE分析，确定融合蛋白的表达情况。

1.2.4 目的蛋白表达条件的优化

1.2.4.1 epEGF融合蛋白诱导剂浓度的优化

挑取鉴定正确的阳性转化子在37 ℃的LB液体培养基（含100 μg/mL氨苄）过夜培养，按1:100的比例转接到100 mL LB液体培养基（含100 μg/mL氨苄）中，37 ℃培养至OD600为0.6～0.8时，分别加入不同浓度IPTG（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L），30 ℃诱导8 h。等量收集菌体，以SDS-PAGE分析不同IPTG浓度下epEGF融合蛋白的表达量，并确定IPTG最佳诱导浓度。

1.2.4.2 epEGF融合蛋白诱导温度的优化

将工程菌在37 ℃的条件下培养至OD600为0.4～0.8时加入0.4 mmol/L的IPTG分别在20、25、30、37 ℃下诱导过夜，收集等量菌体，以SDS-PAGE分析不同温度下融合蛋白的表达量，并确定最佳诱导温度。

1.2.4.3 epEGF融合蛋白诱导培养基的优化

挑取鉴定正确的阳性转化子在37 ℃的LB液体培养基（含100 μg/mL氨苄）过夜培养，按1:100的比例分别转接到LB液体培养基、SOC液体培养基、SOB液体培养基、2×YT液体培养基、TB液体培养基，均含有100 μg/mL氨苄青霉素，在IPTG浓度为0.4 mmol/L，诱导温度为20 ℃的条件下，诱导过夜。分别收集等量菌体，以SDS-PAGE分析不同培养基下重组融合蛋白的表达量，并确定最佳诱导培养基。

1.2.4.4 epEGF融合蛋白诱导时间的优化

将工程菌在37 ℃的条件下培养至OD600为0.6～0.8时加入0.4 mmol/L的IPTG设置诱导温度为20 ℃条件下继续培养，分别在2、4、6、8、10、12 h时间点收集等量菌体，通过SDS-PAGE方法鉴定不同时间段epEGF融合蛋白的表达量，从而确定最佳诱导时间。

1.2.5 目的蛋白的分离纯化与SDS-PAGE电泳分析

利用GST亲和层析法[23]，对已用0.45 μm滤膜过滤的菌体破碎上清进行纯化。pH 8.0缓冲液（10 mmol/L GSH，50 mmol/L Tris-HCl）并收集洗脱液进行SDS-PAGE电泳分析。

收集到的GST纯化样品经超滤管浓缩后，置换其中的GSH，再用0.22 μm滤膜过滤后按照上述方法上样至阴离子交换柱（Q Focurose 6HP 5 mL），按照Q柱纯化方法进行融合蛋白的第二步纯化。收集Q离子柱洗脱液，收集洗脱液后进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.6 蛋白浓度计算方法

应用软件Image J分析蛋白电泳条带，Image J方法是利用灰度值来近似估算蛋白的纯度，条带的深浅和面积综合代表蛋白的量；利用Bradford[24]方法测定优化诱导工艺和纯化后蛋白浓度；目的蛋白的相对含量利用如下公式计算。

对浓度的计算公式如下：

1.2.7 数据处理

数据分析与处理利用软件Graphpad prism 8.0。

2 结果与讨论

2.1 重组人表皮生长因子表达载体的构建与鉴定

以带有目的片段epEGF的PUC57质粒为模板，通过PCR扩增得到带有酶切位点的基因片段。PCR扩增结果如下图2a所示。从图中可以看出PCR产物条带单一且明亮，特异性得到目的PCR产物。目的片段的长度在250 bp左右，与预期结果相符。

按照材料方法1.2.2描述，对PCR产物与质粒PGEX-4T-1分别用BamH 1和Xho 1进行双酶切，体外连接构建重组表达载体pGST-epEGF，并转化大肠杆菌，利用氨苄抗性平板进行抗性筛选，利用菌落PCR鉴定阳性转化子。菌落PCR鉴定结果如图2b所示。从图中可以看出，编号1～10的菌株的菌落PCR产物片段在1000 bp左右，与理论值相符，初步判断重组质粒pGST-epEGF对应的转化子已构建成功。

菌落PCR鉴定正确的转化子，将其接种到LBA液体培养基中过夜培养，保存甘油菌并提取重组质粒进行双酶切鉴定，结果如图2c所示。从图中可以看出，酶切2条带大小约为5000 bp和250 bp，符合理论结果，可以基本判定重组表达质粒成功构建。

图2 重组人表皮生长因子表达载体的鉴定； Fig.2 Identification of recombinant human epidermal growth factor expression vector

将1～5号菌株的质粒，送至生工生物工程（上海）有限公司进行基因测序，测序结果与目的基因比对完全正确，可以得出结论重组表达质粒已成功构建。

2.2 目的蛋白的表达与SDS-PAGE分析

按照“1.2.3”对重组人表皮生长因子工程菌进行发酵，取重组菌BL21（DE3）-pGST-epEGF未诱导与诱导的发酵液离心后的菌体，加入蛋白上样缓冲液，煮沸后直接SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示。可以看出在36 ku处出现明显条带，而未诱导菌株无明显此条带，与预期结果一致，即初步说明重组菌株表达了重组epEGF。

图3 重组工程菌SDS-PAGE鉴定Fig.3 SDS-PAGE Identification of recombinant engineered bacteria

2.3 融合蛋白发酵条件优化

2.3.1 IPTG浓度优化

图4 融合蛋白表达条件中诱导剂浓度的优化Fig.4 Optimization of inducer concentration in fusion protein expression condition

如图4所示，以不加IPTG诱导的菌株作对照，分别在0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L，不同浓度的IPTG诱导下对重组菌株进行发酵培养，分析不同浓度下SDS-PAGE电泳图，利用1.2.6蛋白浓度计算方法，计算目的蛋白表达的相对含量；结果表明，在其他条件一样的情况下，当IPTG的浓度为0.4 mmol/L时，目的蛋白占总蛋白的含量最高，约为0.13 mg/mL。在诱导剂浓度偏高或偏低时，蛋白表达量均有所降低，因而认为融合蛋白epEGF最适诱导剂浓度为0.4 mmol/L。

2.3.2 温度优化

图5 融合蛋白表达条件中诱导温度的优化Fig.5 Optimization of induction temperature in fusion protein expression condition

在发酵过程中分别设定不同的诱导温度（37、30、25、20 ℃），研究温度对工程菌表达目的融合蛋白的影响。结果如图5所示，温度对工程菌表达目的蛋白有影响。当诱导温度设置为20 ℃时，蛋白表达量明显高于其他对照组，此时蛋白含量为0.12 mg/mL。即工程菌最优表达温度为20 ℃。

2.3.3 培养基优化

选择了5种常用的细菌培养基，LB（Luria-Bertani）、SOB（Super Optimal Broth）、SOC（Super Optimal broth with Catabolite repression）、TB（Terrific Broth）、2×YT（2×YT medium）来探究培养基对蛋白表达的影响，结果如图6所示。使用TB与SOC后，蛋白表达量较其他培养基有所提高，其中TB对蛋白含量的提高最为明显。可能原因是这两种培养基含有葡萄糖，提供更多的碳源，有利于蛋白质的合成，即工程菌BL21（DE3）-pGST-epEGF最适发酵培养基为TB培养基。

图6 融合蛋白表达条件中培养基的优化Fig.6 Optimization of medium under the expression conditions of fusion protein

2.3.4 诱导时间的优化

在诱导过程中0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，分别取等量菌体，直接取适量菌体进行SDS-PAGE电泳，结果如图7所示。在诱导2 h时已经有目的蛋白的表达，2 h～8 h内，随着时间的增加，目的蛋白表达量也在逐步增加，超过8 h后，随着时间的增加，目的蛋白表达量逐渐减少，故确定8 h是工程菌最适诱导时间。发酵液目的蛋白最终浓度为0.12 mg/mL。

图7 融合蛋白表达条件中诱导时间的优化Fig.7 Optimization of induction time in fusion protein expression condition

2.4 融合蛋白的初步纯化

2.4.1 融合蛋白GST Focurose 4FF亲和层析

按照材料与方法1.2.5中描述GST亲和层析柱操作方案对破碎液上清进行第一步纯化，结果如图8所示。上清经GST一步纯化，得到目的蛋白纯度为66.82%（图8a融合蛋白表达各个步骤SDS-PAGE电泳图，图8b为纯化阶段的色谱图穿透峰和洗脱峰如图上箭头所注）；收集洗脱液进行超滤浓缩，置换其中的还原型谷胱甘肽，浓缩后的样品用于融合蛋白的第二步纯化。

2.4.2 融合蛋白阴离子交换层析

超滤浓缩后的样品经Q Focurose 6HP阴离子柱纯化后，结果如图9所示。从图中可以看出目的蛋白在0.4 mol/L NaCl浓度条件下被洗脱下来，利用Image J进行灰度扫描，显示纯化后的目的蛋白纯度达到92.57%。

图8 融合蛋白GST亲和层析柱纯化结果Fig.8 Purification results of fusion protein GST by affinity chromatography column

图9 融合蛋白阴离子交换层析柱纯化结果Fig.9 Purification results of fusion protein on anion exchange chromatography column

2.5 讨论

本研究构建重组大肠杆菌BL21（DE3）/PGEX-4T1-epEGF，成功表达可溶性的含有细胞穿膜肽的人表皮生长因子，通过发酵条件优化，目的融合蛋白的量可达0.13 mg/mL。相对黄秉仁等[25]在酵母中表达的含量4 mg/L提高了32.5倍，且表达周期相比酵母系统大大缩短。同样在大肠杆菌中，甘人宝等[26]合成pAE-8表达质粒，在大肠杆菌中的表达量为1.5 mg/L。赵忠良等[27]也将EGF与GST标签进行融合表达，但是其EGF的表达量只占细菌总蛋白的18%，本研究构建的融合蛋白通过特殊表达载体，创新性的添加人工合成细胞穿膜肽Pep-1融合表达，利用tac启动子表达水平提高到21.58%。传统分离纯化人表皮生长因子需经过8种分离工艺与2步柱层析[16]，本研究中重组蛋白经过2步柱层析，纯度达到92.57%，简化了纯化工艺，大大节约了成本，为其工业化生产提供了可能。

3 结论

人表皮生长因子（hEGF）在皮肤损伤修复中具有显著作用，获取高产EGF的重组基因工程菌成为热门的研究方向。本研究构建了含有穿膜肽的人表皮生长因子，即重组Pep-1-hEGF（epEGF），并在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白GST-epEGF。论文也研究了发酵条件对融合蛋白的影响，发现最适发酵条件为：IPTG浓度为0.4 mmol/L、温度为20 ℃、最适发酵培养基为TB液体培养基、诱导时间为8 h。通过添加GST促溶标签与发酵条件优化，明显提高目的蛋白的可溶性表达，目的蛋白表达量占总蛋白的21.58%，可达0.13 mg/mL。通过GST亲和层析与阴离子交换层析两步纯化后目的蛋白的纯度达到92.57%。本研究成功实现了人表皮生长因子在大肠杆菌中的可溶性表达，并对其进行了初一步纯化，后续尝试采用肠激酶处理，去除GST标签，以便获得更理想的无免疫副反应的人表皮生长因子蛋白。