酱油发酵基料中染料木素的抗氧化活性评价

李一峰，朱毅，梁雪莹，李伟，符姜燕，扈圆舒，蔡惠钿，彭名军，曹庸*

（1.华南农业大学食品学院，广东省功能食品活性物重点实验室，广东省天然活性物工程技术研究中心，广东广州 510642）（2.广东美味鲜调味食品有限公司，广东中山 528437）（3.广州市食品检验所，广东广州 510410）

大豆异黄酮为12种大豆天然异黄酮的统称，是一类多酚化合物，其化学结构与17β-雌二醇类似，又被称为植物雌激素[1]。大豆异黄酮分为游离型苷元和结合型糖苷，自然界中大豆异黄酮主要以结合型糖苷的形式存在，但人体吸收游离型苷元的能力更强，所以游离型苷元更能发挥其生物活性[2]。染料木素作为大豆中游离型苷元的主要成分，其具有抗氧化、治疗糖尿病[3]、抗阿兹海默氏病[4]、治疗更年期综合症[5]、抗肿瘤[6]、神经内分泌和神经免疫[7]等作用。染料木素作为天然产物，原料易得、毒副作用小等特点也为它带来了巨大的市场潜力。

酱油发酵基料是大豆经过发酵后剩余的基料，产量大，价格低，含有油脂、蛋白等多种营养成分。大豆异黄酮、膳食纤维、低聚糖等活性物质的存在，使酱油发酵基料的回收利用成为热门话题[8]。原大豆异黄酮主要是以糖苷形式（97%～99%）存在，苷元（大豆苷元、染料木素和黄豆黄素）含量少（1%～3%），糖苷需降解为苷元才能够被小肠吸收。大豆经过酱油发酵，苷元含量大幅提高，由于游离型苷元难溶于水，其大部分残留在酱油发酵基料中[9]。研究表明，染料木素在酱油发酵基料中剩余率可达到95%[10]。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），有雌雄同体或雄体两种性别，雌雄同体具有959个不变的体细胞。虽然秀丽线虫体型微小，但其具有比较完整的生理系统，如神经、性腺、咽腺、肌肉以及免疫等系统。83%秀丽隐杆线虫蛋白质组被预测为具有人同源性，线虫和哺乳动物之间高度保守的基本生物分子和细胞信号通路，例如胰岛素信号通路、先天免疫调节通路、突触机制和蛋白质稳态所涉及的系统[11]。秀丽线虫本身具有微量、生长周期短、后代数量巨大、通体透明易于观察等优点，因此成为科学研究中被共同认可的生物模型之一。秀丽隐杆线虫已被广泛运用于抗衰老[12]、减肥[13]和生殖毒性[14]等活性研究。

适量的天然活性物对动物的抗氧化、生长和繁殖性能起一定的促进作用，但高剂量的天然活性物可能会对动物的机体性能产生抑制作用。“权衡”机制宣称延长寿命将以减少或丧失生殖能力为代价[15]。畜禽业和水产养殖业的快速发展，使染料木素等植物雌激素被广泛应用于饲料中，但有学者指出，长期使用植物雌激素可能造成动物机体内分泌紊乱，从而对家畜的生理机能造成损害[1]。抗氧化物质大多具有清除生物体内自由基、激活体内防御酶体系能力，从而达到延缓机体衰老的目的，植物多酚摄入机体后具有很强的抗氧化能力，但是否会对身体产生有害作用，也是人们研究的重点。因此染料木素的安全使用量及功能活性备受关注。本研究以秀丽隐杆线虫为模型，通过测定线虫寿命、生殖能力、运动能力、热应激、体内抗氧化酶活力等指标，研究染料木素对线虫健康寿命的影响，并找出合理、经济添加量，以期为染料木素作为天然抗氧化剂的推广应用供理论依据和发展思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱油发酵基料由海天调味食品股份有限公司提供，存放在4 ℃冰箱中，染料木素标准品（含量≥98%）购买于上海源叶生物科技有限公司。

无水乙醇、三氯乙酸、30% H2O2、水杨酸等，分析纯，购于天津市永大化学试剂有限公司；HCl（分析纯），购于重庆川东化工有限公司；菲啰嗪一钠盐、DPPH自由基，购于上海蓝季科技发展有限公司；邻苯三酚、NaOH、FeSO4等购于广州化学试剂厂；MDA、CAT、SOD、GSH等试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

AL104万分之一电子天平，Mettler；KQ-500B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；LDZX-40B型立式自控电热蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；SMZ-T4连续变倍体视显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；SWCJ-A超净工作台，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；En Spire酶标仪，Perkin Elmer公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

酱油发酵基料中大豆异黄酮的提取：500 g酱油发酵基料（精准称量至0.01 g）于5 L烧杯中、用固液比1:10条件下加入蒸馏水脱盐，离心去掉上清，沉淀中加入85%乙醇磁力搅拌30 min，萃取三次，合并上清后浓缩，浓缩后加入适量石油醚脱油，烘干。

染料木素的纯化：硅胶经烘干预处理后湿法装入层析柱（2.0 cm×50 cm）中，压紧。准确称取一定量的大豆异黄酮提取物粗提物溶解于少量的甲醇后与少量硅胶混匀，加到柱上方，用洗脱剂进行解析，将含有染料木素的洗脱液合并蒸干，将柱层析产物溶于热的60%乙醇中，冷却，过滤。55 ℃真空干燥得到浅黄色染料木素结晶。将样品进行高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）检测。

染料木素标准品：称量10 mg染料木素，用85%乙醇定容至10 mL容量瓶，配成1 mg/mL标准储备液，分别吸取100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL标准储备液，用85%乙醇稀释定容到10 mL容量瓶。

色谱条件：色谱柱为Agelapromosil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温36 ℃；进样量10 μL；流动相为0.1%乙酸水溶液和乙腈（B泵）；流速1 mL/min；检测波长为260 nm（UV）；乙腈浓度为10%～85%。

1.3.2 染料木素体外抗氧化活性研究

1.3.2.1 DPPH自由基清除试验

将0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL浓度染料木素溶液以1:3的体积比与0.5 mmol/L的1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)-甲醇溶液混匀，在室温下避光反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度，重复三次[16]。

1.3.2.2 ABTS自由基清除试验

将38.4 mg的2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate), ABTS）中加入2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液，在23 ℃下暗处反应12～16 h，得到ABTS自由基，用PBS缓冲液稀释，使溶液在734 nm下的吸光值在0.7±0.02之间，将0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL浓度染料木素溶液以1:1的体积比与ABTS溶液混合，37 ℃中保温10 min，测定734 nm下的吸光值，重复三次[17]。以甲醇为空白对照，抗坏血酸为阳性对照。

1.3.2.3 超氧阴离子自由基清除试验

配备0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL浓度染料木素溶液，取0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲溶液120 μL于96孔板中，分别加入40 μL样液和25 mmol/L邻苯三酚溶液20 μL，震荡摇匀5 min后加入8 mol/L HCl溶液20 μL终止反应，在325 nm波长下检测吸光值，重复三次[17]。

1.3.2.4 羟基自由基清除试验

取0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL浓度染料木素溶液20 μL，分别加入3 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液和9 mmol/L H2O2溶液60 μL，37 ℃避光反应30 min，在510 nm处检测吸光值，重复三次[18]。以甲醇为空白对照，抗坏血酸为阳性对照。

1.3.3 染料木素对秀丽隐苷线虫抗氧化活性的影响

1.3.3.1 培养基的制备

三角瓶中分别加入NaCl、琼脂、胰蛋白胨，加水定容到1 L，摇匀后121 ℃灭菌30 min。冷却后分别加入1 mL灭菌后的CaCl2、MgSO4和胆固醇溶液，再加入25 mL磷酸钾缓冲液，摇匀后趁热倒入培养皿中，每个10 mL。

1.3.3.2 线虫的培养与同期化

将大肠杆菌菌株OP50涂到培养基中，菌液晾干后接种线虫，在20 ℃培养箱中培养。将NaOH和高氯酸钠混匀作为裂解液，缓冲液将培养皿上的卵和体内有卵的线虫一起冲洗至离心管中，去掉上清，加入裂解液，至虫体裂解后3000 r/min离心30 s，将虫卵打到样品板中。

1.3.3.3 寿命实验

将同期化的野生型线虫，随机挑取60条至给药组（50、100、200 μmol/L染料木素）与对照组，20 ℃下培养，每24 h将线虫转移至新培养皿内，并观察线虫的存活情况。每天记录存活、死亡、失踪和异常的虫子数量[19]，实验重复三次。

1.3.3.4 热应激实验

将同期化L4期的N2线虫，放置在35 ℃的培养箱中[20]，此时设为0 h，每1 h记录线虫的存活情况，至全部死亡，每组3个平行，每个培养皿60条线虫。

1.3.3.5 运动实验

随机挑选50条经过同期化的线虫，在第5、10、15 d随机挑取10条线虫观察同等时间内头摆运动、正弦运动和运动能力，记录标准：A：自发运动；B：触碰后可以运动；C：触碰后头尾轻微运动。

1.3.3.6 产卵实验

将同期化L4期的N线虫，随机挑取2条至加药组与空白对照组，每组5个培养皿，每24 h把虫子转移至新的培养皿中，记录虫子每天的产卵量。

1.3.3.7 抗氧化指标

将同期化L4期的N2线虫，破碎后离心，取上清液，用试剂盒检测过氧化氢酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）水平。

1.3.3.8 活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）自由基测定

经染料木素培养96 h后，M9缓冲液清洗去除大肠杆菌，用铂金丝挑取50条线虫，转移到96孔板中，加入荧光探针H2DCF-DA[21]，在发射波长为528 nm，激发波长为485 nm条件下测定荧光强度，每组重复3次。

1.4 数据处理

所有实验均至少重复3次，结果以平均数±标准差表示，并通过SPSS 23.0软件采用单因素方差分析法（ANOVA）进行显著性分析，p＜0.05则为显著差异。其中，柱状图、生存曲线使用GraphPad（ANOVA）（mac 6.00版）软件进行分析作图。

2 结果与讨论

2.1 HPLC检测染料木素体外抗氧化活性的测定

图1 染料木素单体HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of genistein monomer

表1 不同样品染料木素含量和得率Table 1 Genistein content and recovery rate of different samples

酱油发酵基料中染料木素的含量为0.43%，经过提取后所得染料木素粗提物含量为12.75%，得率为87.91%。将粗提物用硅胶进行柱层析分离得到染料木素单体，含量为96.78%，得率为18.94%。将所得染料木素单体用于后续线虫实验。

2.2 染料木素体外抗氧化活性的测定

图2 染料木素对自由基的影响Fig.2 Effects of genistein on free radicals

自由基在机体代谢过程中不断产生，当体内自由基过多，抗氧化物质不足以抑制时，诱发多种疾病，最终导致机体衰老[22]。

图2a表明，染料木素清除DPPH自由基能力呈浓度依赖性，IC50为0.35 mg/mL，在0.125～0.5 mg/mL范围，随着样品质量浓度增大，对DPPH自由基清除能力快速上升，在浓度为2.0 mg/mL时，DPPH清除率达到69.71%。从图2b可知，染料木素清除ABTS自由基能力在0.125～0.5 mg/mL范围，随浓度增加呈较陡趋势，随后趋于稳定，在浓度为2.0 mg/mL时，DPPH清除率达到86.89%，IC50为0.16 mg/mL。图2c表明，随着染料木素浓度增加，清除超氧阴离子自由基能力越来越强，IC50为0.29 mg/mL，在0.5 mg/mL质量浓度后清除率保持稳定，2 mg/mL最大清除率为68.33%。由图2d可得，在0.125～1.0 mg/mL范围，染料木素清除羟基自由基能力增加迅猛，随后趋于平稳，在浓度为2.0 mg/mL时，羟基自由基清除率可达到76.62%，IC50为0.72 mg/mL。

自由基的清除能力是体外抗氧化能力评价中广泛采用的评价指标，总结来看，染料木素在DPPH自由基、ABTS自由基、超氧阴离子及羟基自由基的清除试验中，虽清除效果低于同等样品浓度下的抗坏血酸，但依然表现出有效的抗氧化能力，由此可知，染料木素是一种具研究潜力的抗氧化剂。染料木素会比自由基优先进入生物膜，并通过降低自由基的流动性来抑制生物膜的氧化，同时抑制自由基进入生物膜[23]。大量研究也表明，植物多酚具有良好的抗氧化能力，如茶多酚等[24]，郭虹雯等[25]发现武夷岩茶多酚ABTS清除活性分别为140.27 mg GAE/g；DPPH清除活性分别为182.66 mg GAE/g。李伟等[26]研究指出桉叶多酚具有清除超氧阴离子自由基能力，当浓度为2.56 mg/mL时超氧阴离子自由基能力清除率为41.16%，表明染料木素清除超氧阴离子自由基能力更优于桉叶多酚。

2.3 染料木素对线虫寿命的影响

研究指出，机体缺乏雌激素，会导致体内自由基清除减少、氧化应激升高。染料木素作为雌激素替代疗法，可以通过降低氧化应激对机体损伤的方式达到延缓衰老的目的[27]。与对照组相比，用浓度为50、100和200 μmol/L的染料木素处理野生型线虫，会使线虫存活曲线显著向右移动（图3），分别将平均寿命分别延长了17.54%、20.88%及17.72%，同时显著增加了秀丽隐杆线虫的中位寿命和最大寿命（表2）。其中100 μM浓度染料木素效果最好，能延长12.14%中位寿命和34.55%最大寿命，抗衰老最强。大量研究表明，许多具有抗氧化活性的植物多酚也具有抗衰老作用，例如槲皮素、白藜芦醇等[28]。亚麻木酚素是一种植物雌激素，Lu等[30]发现，500 μmol/L亚麻木酚素能显著提高线虫22.00%平均寿命。而100 μmol/L染料木素抗衰老能力与500 μmol/L亚麻木酚素相近。研究指出，DAF-16/ FOXO通路促进长寿，热休克转录因子1（HSF-1）增加了老daf-2突变体线虫的免疫能力，p38促分裂原激活的蛋白激酶1（PMK-1），是免疫力的关键决定因素[30]。

图3 染料木素对线虫寿命的影响Fig.3 Effects of genistein on the lifespan inC. elegans

表2 线虫存活时间统计学分析Table 2 Statistical analysis of survival time inC. elegans

表3 热应激下线虫存活时间统计学分析Table 3 Statistical analysis of survival time inC.elegansunder high temperature stress

2.4 热应激下染料木素对线虫寿命的影响

在现代集约机械化养殖模式下，牲畜更易处于应激状态，自由基容易堆积在动物体内，对机体造成损伤，不仅降低动物的抗压能力，同时对生产性能也造成破坏[31]。增强耐环境应力，是提高环境压力下存活率的关键因素[32]。在热应激条件下，50、100和200 μM的染料木素处理野生型线虫，会使线虫存活曲线向右移动（图4），并显著延长线虫15.32%、23.88%及16.65%平均寿命，同时显著提高线虫的中位寿命和最大寿命（表3）。其中100 μmol/L浓度染料木素效果最好，能延长21.74%中位寿命和26.32%最大寿命，抗热应激能力最强。研究指出，苦瓜皂苷可以提高热应激条件下线虫11.00%的平均寿命，并提高了野生型线虫11.00%的平均寿命，在提高抗逆性的同时改善了线虫的健康寿命[33]。而染料木素的抗热应激能力更强于苦瓜皂苷。研究指出，与野生型N2动物相比，grk-1突变体可从急性热应激中恢复更多。G蛋白偶联受体激酶（GRKs）调节秀丽隐杆线虫的热应激反应[34]。

图4 热应激下染料木素对线虫寿命的影响Fig.4 Effects of genistein on the lifespan inC.elegans under high temperature stress

2.5 染料木素对线虫寿命生理功能的影响

运动过程中，运动疲劳会引起机体氧化应激损伤，导致抗氧化能力降低[35]。机体的衰老伴随着运动能力的下降和表明肌肉的物理退化。如图5，分析了线虫生命的早、中和晚期（分别在第5、10及15 d）的运动情况，经过不同浓度染料木素处理后，不同时期线虫的自发运动比例高于对照组，尤其是在中晚期。此外，通过对线虫身体弯曲频率（正弦运动）和头摆频率来评价线虫不同部位的运动状态，与对照组相比，50、100和200 μmol/L染料木素的介入在不同程度上提高了运动状态，其中在15 d时最为显著，分别提高了线虫25.17%、75.87%和64.34%的头摆频率，并同时提高31.29%、48.25%和33.57%的正弦运动频率。这些结果说明染料木素可以减缓衰老带来的运动能力的退化。

图5 染料木素对线虫生理功能的影响Fig.5 Effects of genistein on the physiological function inC. elegans

为研究染料木素对线虫生殖的影响，测量了线虫产卵周期每一天的产卵量，图5d表明，50、100和200 μmol/L的染料木素处理分别提高17.96%、27.84%和41.37%的产卵总量，说明染料木素能显著提高线虫的产卵总量，且这种提高呈浓度依赖性。研究表明，染料木素可与垂体、下丘脑等处的雌二醇受体结合[36]，通过影响神经内分泌系统来提升睾酮、生长激素和催乳素在血清中的浓度，达到促进生殖系统的发育和提高繁殖能力[37]的效果。研究指出，在饲料中添加15～60 mg/kg的大豆异黄酮，可显著促进蛋鸡雌二醇和卵黄蛋白原的分泌，提高产蛋鸡生产性能和蛋品质[36]。大豆异黄酮具有的雌激素作用，使线虫的产卵能力显著提高[38]。

2.6 染料木素对线虫抗氧化防御体系的影响

研究指出，体内的抗氧化剂可以提升防御系统的能力，缓解过量ROS引起的氧化应激，酶和非酶抗氧化防御系统在机体保护中起着关键的作用[39]。MDA是一种氧化应激产物，是反应脂质过氧化损伤程度的重要指标。50、100和200 μmol/L染料木素分别显著降低了线虫体内的46.50%、73.52%和62.72% MDA含量，说明染料木素能抑制脂质过氧化反应，从而降低线虫的氧化应激。SOD在清除动物体过多超氧阴离子自由基中起到关键作用[40]，自由基可被体内的SOD转化为毒性较小的H2O2，再通过催化生成H2O，从而减少氧化带来的损伤。50、100和200 μmol/L染料木素分别显著提高线虫体内37.32%、31.51%和44.05% SOD含量。GSH作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应，其通过巯基与体内的自由基结合，可直接使自由基还原成酸性物质，从而加速自由基的排泄，并对抗自由基对机体的损害[41]，较空白组线虫而言，进食50、100和200 μmol/L染料木素的线虫组分别提高10.39%、36.21%和25.84%的GSH含量，同时提高了线虫体内144.52%、253.87%和295.60%的CAT酶活力。结果表明染料木素可能具有激活线虫酶促和非酶促抗氧化防御系统的潜力，对提高线虫体内抗氧化能力、缓解线虫衰老均有积极作用。Chen等[42]发现佛手黄酮可以延长线虫14.94%平均寿命，降低体内56.06% MDA含量，同时提高103.15%和81.91% SOD和CAT酶活性，展现了植物多酚良好的抗衰老活性。

图6 染料木素对线虫寿命抗氧化防御系统的影响Fig.6 Effects of genistein on the antioxidant defense system inC. elegans

2.7 染料木素对线虫活性氧自由基积累量的影响

过量的活性氧（ROS）引起的氧化应激是造成细胞结构和生物分子功能受损的原因[43]，过量的自由基通过使细胞老化等方式累加速机体衰老，从而破坏蛋白和DNA，最终引起癌症等慢性疾病[44]。染料木素结构中的含有多个酚羟基，不仅可以成为自由基的供氢体，还可以螯合有害金属离子，来增强其与自由基结合的能力，从而清除机体内的自由基。经过染料木素96 h处理，50、100和200 μmol/L浓度的染料木素均显著降低线虫体内31.22%、38.57%和41.40%活性氧的积累量，这表明染料木素在线虫体内表现较强的抗氧化能力。有研究指出，植物多酚如二氢杨梅素等能通过抑制肿瘤细胞增殖来调节ROS的表达水平，从而发挥抗氧化损伤的作用[45]。姜黄素是姜科植物中的酸性多酚，Lin等[43]指出姜黄素可以清除体内的ROS，降低过氧化脂质水平，减轻紫外线造成的DNA损伤，从而达到抗氧化作用。Lin等[43]在用鼠尾草酚喂养线虫中发现，浓度为180 μmol/L时，鼠尾草酚可以降低线虫体内76% ROS积累量。

图7 染料木素对线虫活性氧积累量的影响Fig.7 Effects of genistein treatment on ROS accumulation in C.elegans

3 结论

本文研究结果表明酱油发酵基料中染料木素在体外能有效清除DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基及超氧阴离子自由基，具有良好体外抗氧化能力。进一步实验以秀丽隐杆线虫模型评价染料木素的体内抗氧化能力，发现50、100和200 μmol/L浓度染料木素能显著提高正常和热应激下线虫寿命，改善线虫运动能力，且提高产卵能力。此外，染料木素能显著降低线虫体内ROS积累和MDA水平，提高CAT活性、SOD活性及GSH含量，改善线虫抗氧化防御能力，具有良好体内抗氧化作用，其中100 μmol/L染料木素抗氧化效果最好。本研究初步探究了染料木素的体外抗氧化和对秀丽隐苷杆线虫的体内抗氧化活性，但起抗氧化作用的保护机制通路还有待深入开展研究。总体来说，染料木素具有抗氧化延长健康寿命的作用，为染料木素在医药、饲料、保健品的添加量提供理论指导。