桔甘片对急性酒精性肝损伤小鼠的保护作用

谢丽雅，董宇，徐晓波，沈琼，李文强，李伟，任珅，王梓*

（1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118）（2.通化县农产品质量安全监督检测中心，吉林通化 134100）

酒精性肝损伤是我国常见的肝脏疾病，主要包括肝脏脂肪变性，酒精性肝炎，肝纤维化，严重发展为肝硬化甚至肝癌[1]。在我国，酒精性肝损伤发病率日益增加，严重危害人民健康。越来越多的研究发现，酒精性肝损伤发生主要是由于酒精在机体代谢过程中会通过多种途径产生大量活性氧（ROS）[2]，造成抗氧化活性降低和脂质过氧化升高，破坏机体氧化还原平衡，从而破坏线粒体功能，诱发氧化应激，最后导致肝损伤[3]。在早期，临床上治疗酒精性肝损伤的措施主要集中在戒酒、营养支持、药物辅助治疗，但长期服用药物会产生不良反应。近年来，研究发现许多天然植物提取物及中药复方制剂因其具有抗氧化、抗凋亡活性在酒精肝疾病方面起到重要作用[4,5]。

桔梗汤是中医辨证理论指导下的经典复方制剂，由桔梗与甘草两味药配伍组成[6]，前期研究发现桔梗汤中主要含有桔梗皂苷D、甘草酸、甘草苷等化学成分，表现出较好的抗炎[7]、抗氧化[8]、免疫调节[9]等药理活性。此外，有研究者发现桔梗汤在一定程度上对肝脏损伤具有保护作用[10,11]。由于汤剂在临床应用中有不易服用，味苦等缺点，限制了其在日常生活的应用和推广。为进一步提升桔梗与甘草配伍的实用性，依据桔梗汤的功效特点，课题组前期开发出集口感好、易吸收、携带方便于一体的新型精深加工健康保健产品-“桔甘片”，该产品能很好地解决桔梗汤服用所产生的口感等问题。

目前，关于中药复方片剂保肝作用研究鲜见报道，本研究以现代生活中较为常见酒精性肝损伤为切入点，通过建立小鼠体内急性酒精肝损伤模型，初步探讨桔甘片（JGT）对酒精诱导小鼠急性肝损伤的保护作用，为把JGT开发为保护肝损伤的药物和保健食品提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料、仪器和试剂

1.1.1 主要实验仪器

Waters e2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；H1650R高速冷冻离心机，北京宏达恒业科技有限公司；JJ-2高速组织匀浆机，上海比朗仪器制造有限公司；BioTek-EPUCH2酶标仪，美国分子生物仪器公司；RM2245半自动石蜡切片机，徕卡显微系统上海有限公司；Leica DM 2500荧光显微镜，德国徕卡。

1.1.2 药物与试剂

桔甘片主要由桔梗、甘草、蜂蜜粉组成；联苯双酯滴丸，浙江医药有限公司新昌制药厂；苏木素-伊红染色液（H&E）由上海碧云天生物技术有限公司提供；谷丙转氨酶（ALT)、谷草转氨酶（AST)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）、甘油三酯（TG）试剂盒全部购于南京建成生物工程研究所；乙醇（分析纯，北京化工厂），水为超纯水，乙腈为色谱纯，所有其他未列试剂均为分析级。

1.1.3 实验动物

SPF级雄性ICR小鼠（20～22 g），由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，合格证号：SCXK(吉) 2018-0007动物饲养条件符合实验动物福利伦理委员会的要求，12 h光照或黑夜循环环境，温度为23±2 ℃，相对湿度为50%±5%，提供自由饮水和摄食。

1.2 方法

1.2.1 桔梗汤提取物的制备

先前研究发现，当桔梗和甘草配伍比例为1:2时，桔梗汤中甘草酸、甘草苷、桔梗皂苷D含量最高，且抗氧化能力最强。称取桔梗饮片60 g、甘草饮片120 g，共180 g，加入20倍蒸馏水，浸泡5 h后煮沸，趁热过滤，反复煎煮3次，合并滤液并离心5 min，将上清液置70 ℃水浴锅蒸发浓缩至生药浓度为1.0 g/mL，-80 ℃预冷24 h，用研钵将桔梗提取物研磨，过80目筛，待用。

1.2.2 不同剂量桔甘片的配制

桔甘片是以桔梗汤提取物为主要原料，添加黏合剂、润滑剂、矫味剂等辅料；实验室前期采用单因素考察和正交试验设计方法优化桔甘片配方，筛选出麦芽糊精30%、蜂蜜粉20%、聚维酮（PVP-k30）4%、硬脂酸镁1.5%、桔梗汤提取物44.5%为最佳配伍比例。将主药和辅料充分混匀后过筛，并采用粉末直接压片法制备桔甘片，片重达到0.4 g。精密称量桔甘片56.2 mg、112.4 mg、224.8 mg分别溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液配置成浓度分别为10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL给药样品溶液，待小鼠灌胃备用。

1.2.3 高效液相色谱条件

利用Tnature C18 Superb色谱柱（250 mm×4.6 mm），流动相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）；流速1.0 mL/min，进样量：10 μL；柱温30 ℃。洗脱梯度：0～10 min，20%→25% B；10～55 min，25%→50% B；55～57 min，50%→20% B；57～60 min，20% B，在波长210 nm处测定。

1.2.4 动物分组和给药

所有小鼠在标准动物饲养条件下饲养1周，随后将小鼠随机分成6组（n=8只）：空白组、模型组、联苯双酯阳性组（200 mg/kg)、JGT-L（100 mg/kg）组，JGT-M（200 mg/kg）组，JGT-H（400 mg/kg）组，各给药组按剂量10 mL/kg连续灌胃给药14 d，空白组和模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，末次给药1 h后，除空白组外，剩余组灌胃给予50%酒精（12 mL/kg·bw）致急性肝损伤；12 h后对小鼠进行眼球采血以收集血液样本，离心后取上清用于生化指标检测；将小鼠脱颈处死后，立即取出肝、脾组织。将各肝脏左叶一小部分固定于10%中性缓冲福尔马林溶液，其余肝组织立即放入液氮中并于-80 ℃冰箱保存，用于后续实验，动物实验设计流程如图2所示。

1.2.5 脏器指数的测定

动物实验结束前，对所有小鼠称重。解剖后，迅速取出肝脏，使用0.9%生理盐水去除血液，滤纸吸净后对肝组织称重，计算小鼠脏器指数：

1.2.6 小鼠血清生化标记物的测定

取小鼠血清，根据试剂盒说明书，对AST和ALT两个肝毒性敏感指标及TG的水平进行了检测。

1.2.7 小鼠肝组织匀浆指标测定

精密称取0.2 g肝组织置于2 mL离心管中，加入生理盐水(1:9m/V)后匀浆，在4000 r/min，4 ℃条件下离心10 min，使用BCA蛋白试剂盒对匀浆上清液蛋白浓度进行测定。根据脂质过氧化MDA试剂盒说明书检测肝组织中MDA的含量，谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒说明书测定GSH-Px活性。

1.2.8 组织病理学检查

每组随机选取3只小鼠进行肝脏组织病理学检查。取肝脏左叶一小部分，用10%福尔马林溶液固定2 d以上，流水过夜，酒精脱水，石蜡包埋并切成5 μm切片。切片经脱蜡、水合、苏木精和伊红染色，采用光学显微镜，200倍放大，观察肝组织形态变化。并采用Ridit法分析肝细胞受损程度。

1.2.9 统计学分析

所有数据用平均值±标准差(SD)表示，采用单向方差分析（ANOVA）评估两组间的差异，p＜0.05、p＜0.01或p＜0.001表示有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 HPLC法分析桔甘片（JGT）中化学成分

采用高效液相色谱法，在JGT中检测到甘草苷、甘草酸、党参炔苷、桔梗皂苷D等4种主要活性成分（如图1），其中甘草苷含量为2.41 mg/g，党参炔苷含量为0.03 mg/g，桔梗皂苷D含量为0.5 mg/g，甘草酸含量为0.84 mg/g，上述成分可以作为桔甘片质量控制的重要指标性成分。

图1 标准品（a）和样品（b）Fig.1 Standard references (a) and Samples (b)

2.2 JGT对小鼠脏器指数的影响

表1 桔甘片对急性酒精肝损伤小鼠脏器指数的影响Table 1 Effect of JGT on organ indices on alcohol-induced ALI in mice(x±s, n=8)

如表1所示，与空白对照组相比，各组小鼠体质量没有显著变化，表明JGT与联苯双酯阳性药对小鼠体重没有明显的影响。一次性大剂量酒精冲击后，模型组小鼠肝脏指数较空白组显著增加（p＜0.05），分别达到5.84 mg/g，表明小鼠体内肝组织受损。阳性药和JGT低中高剂量给药后，能够不同程度的降低酒精导致的肝重的增大（p＜0.05），各给药组均具有显著地统计学意义，其中，JGT高剂量组对急性肝损伤小鼠肝重的影响最为显著（p＜0.01），肝脏指数下降到5.32 mg/g。

图2 急性酒精肝损伤模型实验流程图及桔甘片对小鼠血清中ALT、AST和TG的影响Fig.2 Experimental flow chart of alcohol-induced ALI in mice and the effect of JGT on serum ALT (b), AST (c) and TG (d)

图3 桔甘片对急性酒精肝损伤小鼠肝脏中MDA和GSH-Px水平的影响Fig.3 The effect of JGT on the levels of MDA (a) and GSH-Px (b) on alcohol-induced ALI in mice

2.3 JGT对小鼠血清转氨酶和TG的影响

ALT和AST作为非特异性功能酶，广泛存在于心肌组织及肝脏组织，被认为是反映肝细胞损伤的重要指标，当机体肝细胞出现坏死和损伤时，两种血清转氨酶从肝脏渗透到血液，造成血液中ALT和AST浓度升高[12]。据文献报道[13]，甘草提取物能够通过抑制酒精导致的肝组织中ALT、AST水平的升高，从而对肝组织损伤起到缓解和改善效果。本研究结果显示，与空白组比较，50%酒精摄入能够导致血清中ALT、AST水平急剧升高（p＜0.001，p＜0.05），分别达到40.91、31.98 U/L，进一步表明肝组织严重损伤。然而，JGT和联苯双酯预处理可逆转这一现象，并且JGT高剂量组中ALT、AST下降最为显著（p＜0.01，p＜0.001），降低到15.65、16.42 U/L，与阳性药组效果较为接近。此外，我们对TG水平进行了检测，它是反映肝脏脂肪代谢障碍的敏感指标[14]，结果发现，JGT给药对降低TG的浓度有一定作用，其中高剂量组抑制率可达到34.73%，具有显著统计学意义（p＜0.05），上述结果初步说明JGT能够改善小鼠肝组织损伤程度。

2.4 JGT对小鼠肝脏MDA和GSH-Px的影响

MDA是多不饱和脂肪酸过氧化的最终产物之一，具有细胞毒性，也是氧化应激的标志。脂质过氧化是通过自由基氧化细胞膜内的多不饱和脂肪酸，导致组织损伤[15]。由图3a可知，与空白组相比，模型组小鼠体内脂质过氧化终产物MDA明显增多（p＜0.001），达到2.41 nmol/mg；与模型组比较，阳性药组脂质过氧化水平明显降低，降幅达到33.75%（p＜0.01）。同时，JGT不同剂量均能有效抑制MDA含量的升高，其中高剂量组作用效果最强，抑制率达到27.50%（p＜0.05），表明JGT可以显著减轻肝脏的氧化损伤。

GSH-Px属于机体内重要的抗氧化酶，能清除氧化过程中产生的超氧负离子自由基，GSH-Px活力的提高反映机体清除自由基能力的增强，从而保护机体组织免受损伤[16]。图3b结果显示，模型组GSH-Px活性为610.15 U/mg pro，较空白组降低了29.30%。此外，JGT低、中、高剂量预给药处理后，肝组织匀浆中GSH-Px活性分别上升至634.24、802.72、828.81 U/mg pro，并且JGT中高剂量组显著逆转了小鼠体内抗氧化酶的减少（p＜0.05）；这些数据清楚的表明：JGT对酒精诱导的肝损伤具有保护作用，可能部分与其抗氧化活性有关。

图4 桔甘片对急性酒精肝损伤小鼠肝脏病理变化影响Fig.4 Effect of JGT on pathological changes of liver on alcohol-induced ALI in mice

表2 小鼠肝脏病理变化和Ridit分析Table 2 Pathological changes in the liver and Ridit analysis

2.5 JGT对小鼠组织病理学变化的影响

通过光学显微镜对肝组织切片观察，结果发现空白组中央静脉组织细胞核排列规则整齐，形态正常，未见炎症浸润；模型组肝细胞损伤较明显，少量细胞核出现萎缩，排列不规则，见有部分炎症浸润；与模型组比较，各给药组不同程度改善小鼠肝组织损伤，炎症浸润面积明显减小，且高剂量组和阳性组肝细胞形态几乎恢复正常（见图4）。根据肝细胞损伤程度进行评分及Ridit分析，由表2可知，模型组与空白对照组比较表现出更高的肝组织损伤等级，与模型组相比，中、高剂量组损伤等级显著降低（p＜0.05），上述结果表明JGT对酒精诱导的肝组织损伤具有良好的治疗效果。

3 结论

综上所述，JGT能够通过抑制小鼠体内肝功能指标水平的升高，有效降低肝脏脂质过氧化水平，调节肝脏代谢的紊乱，提高小鼠体内抗氧化能力，恢复机体内氧化与抗氧化系统平衡，从而对酒精诱导的小鼠急性肝损伤发挥保护作用。本研究为深度开发治疗酒精性肝损伤药物奠定实验基础，同时更拓宽了药食兼用药材的使用途径。值得注意的是，本文从JGT中检测到甘草苷、甘草酸、党参炔苷、桔梗皂苷D四种活性成分，其中，桔梗皂苷D具有较强的抗氧化能力，可能在保护酒精肝损伤方面发挥主导作用，尽管我们对JGT的肝保护作用做了初步的研究，但JGT对机体其他组织是否具有预防保护作用有待探讨。