棕榈酸抑制果蝇幼虫的生长发育及糖脂代谢

章嘉淇，吴进兰，吴明江，佟海滨

（温州大学生命与环境科学学院,浙江温州 325035）

代谢综合征（Metabolic Syndrome，MS）是一组以中心性肥胖为基础，合并高血压、血糖以及血脂代谢异常等多种代谢紊乱的临床综合征[1]，其被认为是II型糖尿病以及心血管等疾病的主要危险因素[2,3]。由于现代社会生活水平及生活方式的变化，一方面不合理的膳食结构使得民众高糖高脂食物摄入普遍增加，另一方面民众出行及生活方式的改变也导致运动量减少，因此肥胖、糖尿病等代谢综合征患病人群呈现直线上升趋势，我国人口的患病率已高达33.90%[4]。

胰岛素抵抗是代谢综合征发生发展的关键病理基础[5]，与中心性肥胖密切相关。肥胖患者体内大量的游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）会抑制胰岛素对骨骼肌和肝脏等靶器官发挥效应作用，从而导致胰岛素抵抗的发生[6]。同时，高浓度的游离脂肪酸还会导致胰岛β细胞凋亡，从而导致胰岛素分泌绝对不足[7]。多项研究表明膳食脂肪中不同种类的脂肪酸对胰岛素敏感性的影响不同[8]。棕榈酸（palmitate acid，PA）是人体摄入量最多的脂肪酸之一，其以甘油酯的形式广泛存在于动植物油脂中[9]。研究发现PA能够诱导骨骼肌、心肌和肝脏细胞等发生胰岛素抵抗[10]，被认为是致肝细胞脂毒性的主要分子之一[11]。此外，有研究报道高脂饮食会导致神经元中PA积累，PA的过量积累导致大脑胰岛素抵抗和长期增强功能受损，从而导致大脑记忆功能障碍[12]。但PA对代谢综合征等疾病发生发展的影响尚不清楚。

黑腹果蝇因其在代谢调控通路上与哺乳动物有着高度的相似性[13,14]，是研究代谢性疾病较好的模式生物。因此，本研究利用黑腹果蝇作为模式生物，研究PA对果蝇生长发育和糖脂代谢的影响，并进一步探究PA与代谢综合征发生发展之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

野生型黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）w118，购自清华果蝇中心。将果蝇培养于人工气候箱，培养条件为温度25 ℃，相对湿度60%，光照时间12 h。

1.1.2 实验试剂和仪器

棕榈酸（PA）、吐温80：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蔗糖、葡萄糖、酵母、无水氯化钙：生工生物工程（上海）股份有限公司；总蛋白（TP）、葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）检测试剂盒：深圳市库贝尔生物科技股份有限公司；对羟基苯甲酸甲酯：上海达瑞精细化学品有限公司；RNA提取、反转录试剂：北京全市金生物技术有限公司；AL104电子天平：梅特勒-托利多国际有限公司；iMagic-V7全自动生化分析仪：深圳市库贝尔生物科技股份有限公司；Light Cycler®96荧光定量PCR仪：瑞士罗氏诊断应用科学部；Tissue Lyser II组织破碎仪：德国QIAGEN生物技术有限公司；SOPTOP SZMN显微镜：舜宇光学科技（集团）有限公司

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配置

250 mL培养基中含有蔗糖8 g、葡萄糖16 g、玉米粉20 g、酵母8 g、琼脂1.75 g、氯化钙0.18 g、丙酸2 mL、对羟基苯甲酸甲酯0.50 g、吐温-80 2.50 mL、此为本实验中的普通（CTRL组）培养基配方。高脂培养基（PA组）的配置方法与普通培养基基本一致，但需在普通培养基的基础上加入2.50%浓度的PA。

1.2.2 果蝇幼虫生长状态和体重测定

从将果蝇受精卵接种到CTRL组和PA组培养基中开始计时，待果蝇生长到72 h开始对果蝇幼虫进行体重称量以及拍照记录生长情况，之后每隔24 h重复实验，直到大部分幼虫结蛹。

1.2.3 蛹面积与蛹体积测定

将毛刷蘸取少量水后刷在蛹上，小心将其取下摆放在载玻片上，在显微镜下观察拍摄，使用Image J软件测量蛹面积。使用Image J软件测量蛹的长和宽，根据公式（1）计算得到各组蛹体积。

式中：

V——蛹体积；

L——蛹的长度；

W——蛹的宽度。

1.2.4 蛹化率与羽化率测定

成虫蛹化率根据式（2）计算得到

成虫羽化率根据式（3）计算得到。

1.2.5 成虫重量、爬行能力以及翅膀面积的测定

成虫重量：将羽化不超过8 h的成年果蝇转移到新培养基中放置24 h，用CO2麻醉后将雌雄果蝇分开放入培养管，采用分析天平称重后根据式（4）计算得到成虫平均体重。

爬行测试：先将果蝇放入长度20 cm透明空管内在室温环境下适应5 min，轻敲透明管，使所有果蝇掉落于管底，对8 s内爬过10 cm标记线的果蝇数量进行记录，操作每组重复3次，每次重复间隔1 min作为休息时间。对通过标记线的果蝇根据式（5）计算。

翅膀面积：随机收集不同培养基的雌雄果蝇成虫各10只，分离翅膀，在显微镜下拍照，使用Image J软件计算各组果蝇翅膀D区的相对面积。

1.2.6 三酰甘油和海藻糖含量测定

取三龄幼虫，加入0.05% Tween-20的磷酸盐缓冲液，加入2粒3 mm不锈钢珠，于高通量研磨仪中研磨4 min。研磨完成后匀浆于12000转离心5 min，取上清，再于12000 r/min下离心5 min，取上清液120 μL于70 ℃加热5 min，于生化分析仪中测定TG、TP。

取三龄幼虫，用针扎破幼虫腹部后离心，离心结束后取1 μL血淋巴，加入50 μL PBS和1 μL海藻糖酶，在37 ℃下孵育3 h，之后用生化分析仪测定GLU。

1.2.7 果蝇幼虫胰岛素样肽测定

表1 qRT-PCR引物设计Table 1 Designed primer sets forqRT-PCR

收集CTRL组和PA组三龄幼虫样品，每组3个生物样品重复,每个样品7只幼虫，Trizol试剂参照常规步骤提取mRNA，反转录得cDNA。以RP49作为内参基因，荧光实时定量PCR测量胰岛素样肽Dilp2、Dilp3、Dilp5等基因的表达情况。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.4进行统计学分析，组间差异采用t检验分析（*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001）。本研究中的试验结果至少重复3次独立实验。

2 结果与讨论

2.1 PA影响果蝇幼虫的生长发育

为了探究PA对果蝇幼虫生长发育的影响，本实验记录了自72 h起，每隔24 h果蝇幼虫的形态变化情况。如图1所示，在72 h～120 h时，PA组和CTRL组果蝇幼虫形态无明显差异。至144 h时，CTRL组果蝇幼虫已出现白蛹，即结蛹早期的形态，而PA组大部分还处于三龄幼虫后期阶段，生长发育稍滞后于CTRL组。在168 h时CTRL组幼虫大部分已成棕褐色蛹，而PA组大多还处于蛹的早期，蛹颜色较淡，直到192 h时PA组大部分幼虫才发育成棕褐色的蛹。上述结果表明，PA处理会导致果蝇幼虫生长发育滞后。

图1 PA对果蝇幼虫生长状态和速度的影响Fig.1 Effects of PA on the growth state and speed of drosophila larvae

由图2d可见，在72 h～120 h时PA组和CTRL组幼虫体重无明显差异。蛹重如图2a所示，CTRL组果蝇平均蛹重为1.26 mg，而PA组果蝇平均蛹重为1.09 mg，明显低于CTRL组（p＜0.05）。CTRL组蛹面积为2.23 mm2，蛹体积为1.26 mm3，而PA组的蛹面积和蛹体积都有所下降，分别为2.05 mm2和1.13 mm3（图2b、2c）。

果蝇的生长发育经历卵、幼虫、蛹、成虫4个阶段，羽化率和蛹化率是衡量果蝇发育是否正常的重要指标。如图2e、2f所示，CTRL组和PA组果蝇蛹化率在144 h时差异最大，分别为37.50%和22.50%。最终蛹化率CTRL组为65%，PA组为61.25%。CTRL组和PA组羽化率在240 h时相差最大，分别为51.70%和24.40%。最终羽化率CTRL组为93.27%，PA组为83.24%。由此可知，PA组蛹化率和羽化率均低于CTRL组，部分幼虫蛹化后未能羽化，表明PA影响果蝇三龄幼虫后期生长发育，降低蛹化率和羽化率，部分幼虫出现蛹期死亡情况。

图2 PA对果蝇幼虫生长发育的影响Fig.2 Effects of PA on the growth and development of drosophila larvae

2.2 PA影响果蝇成虫个体大小和爬行能力

为了进一步探究PA摄入对果蝇发育的影响，本研究分别检测了雌雄果蝇成虫的体重以及翅膀D区面积的大小。如图3a，PA组雌蝇体重为0.78 mg，雄蝇为0.58 mg，而CTRL组雌蝇和雄蝇体重分别为0.91 mg和0.68 mg，PA组雌蝇和雄蝇的体重均显著低于CTRL组（p＜0.01，p＜0.05）。PA组雌性果蝇D区翅膀面积相比于CTRL组显著减少（图3c，p＜0.001），而雄性果蝇无差异（图3d）。上述结果表明PA对雌性果蝇的翅膀发育影响较大，而对雄性果蝇翅膀未见显著影响。

为了探究PA降低的果蝇体重是否伴随着运动活性的改变，本实验测量了成虫的爬行能力。如图3b所示，PA组果蝇的活跃度低于CTRL组，雌蝇和雄蝇的爬行能力分别降低了41.35%和22.78%。白野等[15]通过在果蝇培养基中添加30%的猪油，发现果蝇羽化率与对照组比较降低了42%，雌雄成虫体重与对照组相比分别显著增加了35.40%和17.40%（p＜0.05）。雄果蝇的爬行能力显著下降，与对照组相比下降了23.30%（p＜0.01），这与本研究中果蝇羽化率降低和运动能力减弱的结果一致，而本研究发现PA处理导致成虫体重减小。

图3 PA对果蝇成虫生长发育的影响Fig.3 Effects of PA on the growth and development of adult drosophila

2.3 PA导致果蝇糖脂代谢紊乱

海藻糖是果蝇血淋巴中循环糖的主要成分，其含量可反映果蝇整体血糖水平[16]。昆虫脂类代谢进程与哺乳动物类似，如果长期摄入过量脂肪酸，就会导致代谢紊乱，脂肪积累过多时则会对器官产生脂毒性[17]。如图4a、4b所示，PA组三龄幼虫血淋巴中海藻糖和TG含量均显著高于CTRL组（p＜0.05）。

与哺乳动物利用胰岛素调控血糖类似，果蝇通过体内类似胰岛素的物质-果蝇胰岛素样肽（Drosophila insulin-like peptides，DILPs）来调控糖稳态。在果蝇8种DILPs中，DILP2、DILP3、DILP5与哺乳动物胰岛素最为相似，尤其是DILP2，其与人类的胰岛素功能极为接近[18]。在脂代谢方面，DILPs可以促进脂肪的合成，使血淋巴中游离脂肪酸减少，而DILPs缺乏可造成脂代谢紊乱，脂肪贮存减少，分解加强，血脂升高[19]。如图4c所示，与CTRL组相比，PA组幼虫体内Dilp2、Dilp3、Dilp5基因的表达均呈现显著性下调（p＜0.01），而DILPs分泌不足会导致果蝇体内糖脂代谢紊乱，这与研究中TG和海藻糖含量显著性升高一致。过量摄入PA会导致脂肪酸大量积累，也会对果蝇器官产生脂毒性，损伤胰岛素生成细胞[20]。Heinrichsen等[21]通过添加20%的椰子油培育出“肥胖”果蝇，发现其体内TG和血糖水平显著升高，这与本研究中TG和海藻糖含量升高结果相似。Birse等[22]发现饲喂含30%椰子油的高脂饲料可以复制果蝇成虫糖尿病模型，果蝇体内TG和血糖含量升高，产生胰岛素抵抗，其可能机制是由于TOR信号通路抑制了三酰甘油脂酶（bmm）的产生，同时促进了脂肪酸合成酶的表达。

图4 PA对果蝇糖脂代谢的影响Fig.4 Effects of PA on glucose and lipid metabolism in Drosophila

3 结论

本研究采用含2.50%浓度的PA培养基喂食果蝇，研究PA对果蝇幼虫体重、蛹化率与羽化率、蛹重、蛹面积、蛹体积、成虫体重、成虫爬行能力、成虫翅膀面积大小以及三龄幼虫体内海藻糖、甘油三酯、胰岛素样肽Dilp2、Dilp3、Dilp5含量的影响。结果表明：相比于CTRL组，PA导致果蝇的蛹化率及羽化率分别降低了3.75%和10.03%，蛹面积和蛹体积有所下降。PA组雌性成虫体重与CTRL组相比减小了0.13 mg，雄性成虫体重减少了0.10 mg。PA组雌蝇的运动活性降低了41.35%，雄蝇降低了22.78%。PA组雌性果蝇翅膀面积明显减小，而雄性果蝇无明显差异。PA组幼虫海藻糖和甘油三酯含量明显升高，而Dilp2、Dilp3、Dilp5的表达量显著下降。以上结果表明PA抑制果蝇的生长发育，扰乱了幼虫的糖脂代谢平衡。同时，本实验中PA处理组的果蝇在幼虫时期生长发育异常，三龄幼虫体内海藻糖和甘油三酯含量偏高，这与儿童及青少年由于不健康的饮食结构摄入大量高脂食物导致机体血糖升高、脂质失调，引发肥胖、胰岛素抵抗并最终导致2型糖尿病等慢性代谢疾病的发病机制相似。因此，研究PA导致果蝇幼虫生长发育异常和糖脂代谢紊乱的机制，可以为高脂饮食导致的儿童肥胖等代谢综合征提供科学依据。