植物乳杆菌Z3对有机磷导致慢性中毒 小鼠的解毒作用

姚敦跳，赵悦，刘仁杰*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118）

（2.内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司,内蒙古呼和浩特 011500）

有机磷农药（OPPs）是一种经济、高效的杀虫剂，应用广泛，不仅给农业生产提供了有力的保障，同时也给人类的生存环境造成污染[1]。对非目标物质也具有一定的毒性，且作用持久。随着社会经济的发展，农药的使用量越来越多，在日常生活中，农药污染已经进入土壤、大气、水体，甚至食物链，导致农残在人体蓄积产生慢性中毒，如：头痛、头晕、乏力、食欲不振、恶心、气短、胸闷等症状。残留的有机磷农药通过食物链进入人体，磷原子同体内胆碱酯酶（ChE）共价结合形成磷酰化酶而失活，阻断神经递质乙酰胆碱的水解，导致乙酰胆碱堆积，造成突触过渡兴奋，抑制神经冲动传导，引发一系列综合症，如神经、生殖及免疫的毒性[2]。在慢性的染毒情况下，多种有机磷均可引起动物ChE活性受到抑制，从而出现中毒的状况，中枢神经系统、肝、肾和血液里均有中毒性的症状，造成不同的损伤[3]。有机磷农药对人类的生产和生活起着重要的作用，但随之也带来了一系列问题。有机磷农残对人体的健康和引起的安全问题值得人们去关注。

自然界中存在着极其丰富的微生物资源，在降解农药中起到重要作用。通过发酵来降解残留的有机磷农药，已经取得了较好的效果[4]。Islam等[5]研究表明，泡菜中分离出来的短乳杆菌可有效降解毒死蜱。Bo等[6]研究表明，酸奶加工过程中，有机磷农药含量随着发酵时间的延长逐渐降低。综上，本研究将利用乳酸菌对慢性有机磷农药中毒小鼠进行干预，并检测一系列指标，分析小鼠肝和脑的细胞受损情况，初步探索乳酸菌对慢性有机磷中毒小鼠的解毒功效，以期为人体农残慢性中毒的解毒提供理论支持和借鉴方法。

1 材料与方法

1.1 动物饲养与道德声明

健康成年雄性昆明小鼠50只，体重25～30 g，由长春市实验动物中心提供，许可证号：SCXK(辽)2020-0001。小鼠按常规饲养并适应环境一周，温度为20～25 ℃，湿度为25%～35%。

1.2 试剂

氧化乐果标准品，购自北京勤诚亦信科技发展有限公司；丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、胆碱酯酶（ChE）、活性氧（ROS）和蛋白质定量检测试剂盒，购自南京建城生物工程研究所。

1.3 植物乳杆菌Z3菌悬液的制备

从东北自然发酵酸菜中分离、筛选植物乳杆菌，经驯化后命名为植物乳杆菌Z3。脱脂乳粉培养基培养24 h，生理盐水洗涤3次，制备菌悬液（～1×1010cfu/mL）。

1.4 慢性有机磷中毒模型的建立

经过预实验摸索有机磷慢性小鼠中毒的模型，随机选择8只小鼠作为空白对照组，另42只小鼠每天皮下注射氧化乐果溶液（3 mg/kg），连续4周，构建慢性有机磷中毒模型，空白对照组同时给予等量生理盐水。试剂盒的方法测定小鼠脑和全血组织的胆碱酯酶（ChE）活性、脑组织活性氧（ROS）含量、肝脏和血清的总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、丙二醛（MDA）含量，以确定小鼠有机磷慢性中毒建模成功。

1.5 灌胃方法

建模成功后，选取32只小鼠分为模型组8只、植物乳杆菌Z3低剂量组（～1×108cfu/mL）、中剂量组（～1×109cfu/mL）和高剂量组（～1×1010cfu/mL）各8只。每天上午9:00，低、中、高剂量组小鼠灌胃植物乳杆菌Z3，剂量为10 mL/kg。模型组与空白对照组灌胃等量生理盐水持续灌胃4周。

1.6 生化指标的测定

灌胃结束后，禁食12 h，眼眶取血，处死，取小鼠肝脏和脑，冲洗表面残留血液。取0.1 mL血，加0.4 mL双蒸水，测ChE活性。另取血3000 r/min离心20 min，测血清MDA和T-SOD值。取脑和肝各0.3 g，加生理盐水制成匀浆，2500 r/min离心10 min，取上清液，测ChE、T-SOD活性、ROS和MDA含量，采用试剂盒方法，按说明操作。

1.7 组织病理学观察

取部分肝、脑组织4%多聚甲醛溶液室温固定24 h，石蜡包埋，切5 μm切片苏木精-伊红染色，400倍光学显微镜下观察各切片的病理变化。

1.8 统计学方法

数据均以平均值±标准误差（SEM）表示，使用单向ANOVA，然后进行LSDt检验来比较组间的差异，p＜0.05表示显著。使用SPSS 17.0进行数据分析。使用GraphPad Prism制作统计图。

2 结果与讨论

2.1 Z3对小鼠ChE活性的影响

通过植物乳杆菌Z3对模型组和对照组的干预，检测对小鼠血和脑组织ChE活性的影响，结果如图1所示。

图1 植物乳杆菌Z3对慢性有机磷中毒小鼠全血和脑组织ChE活性的影响Fig.1 Effect ofLactobacillus plantarum Z3 on ChE activity in blood and brain tissue of mice with chronic organophosphorus poisoning

检测血和脑ChE结果表明：全血的空白组ChE活性为99.86 U/mL，模型组ChE活性为62.20 U/mL，模型组ChE（62.20 U/mL）活性显著低于空白对照组。与模型组相比，植物乳杆菌中、高剂量组ChE活性显著升高（图1a），中剂量组ChE活性提高了31.30%，高剂量组ChE活性提高了36.13%。空白对照组ChE（99.86 U/mL）活性显著高于模型组，表明造模成功。高剂量组ChE（0.96 U/mg）活性显著高于模型组ChE（0.53 U/mg），高剂量组ChE较模型组提高了81.13%，表明高剂量植物乳杆菌组能有效改善脑组织ChE活性，但未使中毒小鼠ChE（0.53 U/mg）水平完全恢复（图1b）。可见，植物乳杆菌能提高有机磷慢性中毒小鼠血和脑的ChE活性，在一定范围内，剂量越大，效果越明显。其作用的机制可能由乳酸菌内含有的有机磷降解酶系协同作用，分解小鼠体内的有机磷农残，从而使老化的ChE被重新激活[7]。

2.2 Z3对脂质过氧化损伤的影响

通过对模型小鼠灌胃植物乳杆菌Z3，对小鼠的脂质过氧化损伤影响，结果如图2所示。

图2 植物乳杆菌Z3对慢性有机磷中毒小鼠血清和肝组织MDA含量的影响Fig.2 Effect ofLactobacillus plantarum Z3on MDA content in serum and liver tissue of mice with chronic organophosphorus poisoning

试验结果表明：对照组小鼠血清MDA（1.68 nmol/mL）含量显著低于模型组MDA（2.94 nmol/mL），高剂量组MDA（2.09 nmol/mL）含量显著低于模型组，对照组血清MAD比模型组低42.85%，高剂量组MDA比模型组低28.91%，表明高剂量Z3干预可降低小鼠血清MDA含量，效果显著（图2a）。模型小鼠肝组织中MDA含量与空白对照组相比差异明显。在肝组织中，氧化乐果使慢性中毒小鼠体内MDA含量增加，氧化损伤严重。与模型组相比，高剂量组MDA（0.66nmol/mL）含量明显低于模型组，说明Z3的中、高剂量组均能显著降低氧乐果致慢性中毒小鼠的MDA（0.79 nmol/mL）含量，中剂量组MDA比模型组低13.92%，高剂量组MDA比模型组低16.46%，但高剂量组作用更显著（图2a）。由此，Z3可有效改善氧乐果致慢性中毒小鼠体内的氧化应激反应，降低自由基对小鼠组织器官的氧化损伤，与周先容等的报道相一致[8]。但其如何降低氧化应激损伤的作用机理有待于进一步研究。

2.3 Z3对血清及肝组织T-SOD值的影响

通过植物乳杆菌Z3对模型组和对照组的干预，对血清中T-SOD值的影响，结果如图3所示。

图3 植物乳杆菌Z3对慢性有机磷中毒小鼠血清和肝组织T-SOD值的影响Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarumZ3on T-SOD activity in serum and liver tissue of mice with chronic organophosphorus poisoning

结果表明：模型组的T-SOD（48.39 U/mL）活性明显低于空白对照组T-SOD（87.82 U/mL），高剂量组T-SOD（75.94 U/mL）活性显著高于模型组，高剂量组T-SOD活性比模型组高56.93%，说明植物乳杆菌Z3高剂量组对提高血清中T-SOD水平有良好的效果（图3a）。模型组的T-SOD（83.08 U/mg）活性与空白组T-SOD（145.27 U/mg）相比有明显差异，慢性有机磷中毒小鼠肝损伤较为严重。中、高剂量组T-SOD活性明显高于模型组，中剂量组T-SOD活性比模型组高56.04%，高剂量组T-SOD活性比模型组高65.14%。可见，中、高剂量组对慢性有机磷中毒小鼠肝组织T-SOD活性有明显的改善作用（图3b）。SOD可清除氧自由基，保护细胞免受损伤，对体内抗氧化能力和氧化稳态有重要影响。乳酸菌具有抗脂质过氧化、清除羟自由基和超氧阴离子的作用。这种特性可能是影响中毒小鼠灌胃前后SOD变化的关键因素。灌胃植物乳杆菌可显著提高T-SOD的活性，其可能的机制是通过上调抗氧化基因、氧化还原酶类基因和端粒酶逆转录基因的转录表达，进而通过生物调节、粘附功能、代谢过程等降低机体的炎症水平，从而减少氧化损伤引起的细胞凋亡[9]。

2.4 Z3对脑组织ROS含量的影响

通过植物乳杆菌Z3对模型组和对照组的干预，对脑组织ROS含量的影响，结果如图4所示。

图4 植物乳杆菌Z3对慢性有机磷中毒小鼠脑组织ROS含量的影响Fig.4 Effect of Lactobacillus plantarum Z3 on ROS content in brain tissue of mice with chronic organophosphorus poisoning

试验结果表明：在脑组织中，模型组ROS（58.67 U/mL）的含量明显高于对照组ROS（18.00 U/mL）；Z3各剂量组的ROS含量均下降，而高剂量组ROS（49.33 U/mL）与模型组ROS（58.67 U/mL）差异明显，模型组ROS比高剂量组高15.92%。低剂量组与高剂量组也有明显的差异。由此可见，Z3中、高剂量组降低ROS含量效果明显（图4）。长期低剂量摄入有机磷农药会加速器官衰竭，缩短机体寿命，通过抑制线粒体ATP合成，导致脑组织核DNA单链断裂，增加ROS含量，破坏细胞的稳态，导致细胞程序性死亡。氧化应激中ROS的过量积累会引起脂质过氧化，增加细胞膜透性，导致关键酶失活，对机体损伤严重。据报道乳酸菌可以有效减少ROS的积累，通过调节抗氧化酶的产生，显著降低细胞的氧化应激[10,11]。与本研究结果相一致。

2.5 Z3对小鼠肝脑组织细胞的影响

图5 肝脏和脑组织学切片Fig.5 Representative histological images of liver and brain slices (stained with hematoxylin and eosin)

通过灌胃植物乳杆菌Z3，对小鼠肝脏和脑组织切片镜检，400倍光学显微镜下观察各切片的病理变化，结果如图5所示。

由图5可见，健康小鼠肝脏切片细胞结构良好，中心静脉完整，肝小叶结构清晰，肝细胞结构正常，染色均匀；模型组肝脏部分坏死，肝小叶结构不同程度受损，肝中央静脉扩张，部分肝细胞脂肪变性，肝窦内有大量坏死细胞碎片，细胞核较厚，Z3剂量组肝细胞损伤程度明显小于模型组，肝细胞轻度增大，少量肝小叶结构受损（图5a～c）。脑组织切片镜检显示，空白对照组神经细胞排列整齐，细胞核形态正常，组织结构完整，组织致密，核仁清晰，细胞周围无水肿；模型组脑神经细胞核增大，神经元和胶质细胞固缩，细胞排列紊乱；Z3组脑神经细胞排列整齐，细胞形态正常（图5d～f）。有机磷农药进入人体后主要在肝脏转化，在肝脏中分布浓度最高，在代谢过程中产生大量氧自由基，对肝脏细胞造成损害的同时，随着血液循环损伤脑组织[12]。机体通过酶系统和非酶促的抗氧化系统来应对氧化应激损伤。本研究中通过植物乳杆菌Z3的摄入，有助于保护和修复机体脏器的损伤，与李常坤等的研究结果相符[13]。

2.6 讨论

在有机磷慢性中毒小鼠的大脑中，乙酰胆碱能受体数量减少，胆碱能递质亲和力降低，机体对ChE有耐受性，使胆碱能神经持续兴奋，影响中枢和外周神经系统ChE的抑制作用[14]。乙酰胆碱（ACh）在胆碱能突触上积聚，胆碱能受体被过度刺激，出现震颤、肌肉抽搐等有机磷中毒症状[15]。脑组织中的ChE失活，导致神经递质ACh积聚，出现代谢紊乱、神经系统反应迟钝等一系列症状。有机磷农药通过食物链进入人体，不断的蓄积后对机体造成慢性损伤：破坏免疫系统；抑制人体ChE的活性；慢性有机磷中毒的临床表现为隐匿性和非特异性，使人们在日常生活中缺乏必要的重视和防护。植物乳杆菌能激活衰老和失活的ChE，起到一定得解毒效应，减少神经递质ACh的积累，一程度上恢复ChE的活性，修复机体损伤。MDA含量间接反映了自由基对机体损伤的程度，MDA会引起大分子物质的交联聚合，产生细胞毒性。MDA含量越高，生物膜破坏越严重[6]。本研究中植物乳杆菌Z3高剂量组MDA含量与模型组有显著差异，说明植物乳杆菌可改善肝组织氧化应激损伤，减轻有机磷中毒对机体的影响。综上可见，植物乳杆菌Z3对有机磷慢性中毒小鼠有一定的解毒作用：能显著改善氧乐果中毒所致的肝和脑组织损伤，恢复部分ChE活性。这一结果与微生物体外降解有机磷农药的报道相一致。

3 结论

目前，人们的生活已经离不开被有机磷农残污染的食品、蔬菜、水果，甚至水源，这些农药残留通过食物链进入人体，并随着农药的使用而蓄积，从而导致农残慢性中毒。本论文通过灌胃植物乳杆菌Z3，发现对慢性有机磷中毒小鼠具有一定的解毒作用，研究结果对人体内农药残留的分解、排出具有借鉴意义，为修复农残导致的机体损伤提供理论支持。