龙眼、枸杞和红枣多糖的理化性质及其协同益生活性

周文君，池建伟，易阳，张名位，张瑞芬，刘磊，贾栩超，董丽红，黄菲*

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023）（2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业农村部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610）

龙眼（Dimocarpus longanLour.）为无患子科龙眼属常绿乔木，主产于广东、海南、广西等地区，是典型的南方特色水果。龙眼多糖（longan polysaccharide，LP）是龙眼中最丰富的活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性[1]。枸杞（Lycium barbarumL.）属于茄科枸杞属落叶灌木植物，主产于宁夏、甘肃、青海、新疆等地，是我国西北干旱地区重要经济作物[2]。枸杞多糖（goji polysaccharide，GP）是枸杞的主要活性成分，具有抗糖尿病、改善睾丸功能、抗衰老、免疫调节、抗结肠癌、细胞保护和神经调节等功效[3]。红枣（Zizyphus jujubeMill.）是鼠李科枣属植物枣树的果实，主产于新疆、河南、山东、河北等地区，是典型的北方特色水果。红枣多糖（jujube polysaccharide，JP）是红枣的主要活性物质，具有抗衰老、增强肌力、护肝抗炎、降血糖、免疫调节等多种生物活性[4,5]。研究发现不同来源多糖的结构和活性均有显著差异[6]。虽然关于龙眼、枸杞和红枣多糖的研究已有较多报道，但对于三种多糖的理化特性和活性差异的研究较少。将南方特色水果龙眼、北方特色水果红枣和西北干旱地区经济作物枸杞中的多糖进行比较，明确其构效关系，对丰富植物多糖的理论研究有重要意义。

研究发现多糖因大分子结构难以被机体直接消化吸收利用，需要依赖于肠道菌群酵解利用，通过影响肠道菌群构成及其代谢产物发挥其生理功能[7]。多糖对肠道菌群的影响主要体现在促进肠道益生菌增殖、增加益生菌丰度[8]。如山药多糖、发酵黄精多糖、蛹虫草多糖等可增加小鼠结肠内双歧杆菌属、乳酸菌属、罗斯氏菌属等益生菌的丰度，降低另枝菌属、螺杆菌属、梭菌属链球菌属、大肠杆菌、肠球菌等肠道病原菌的丰度，对肠道功能有一定的保护作用[9-11]。因而，植物多糖对益生菌的影响受到越来越多的关注，多糖通过调节益生菌进而发挥其他生理功效成为一种新的研究方向。

单一多糖的功效一般具有一定的局限性，有研究发现将多糖按照一定的比例复配后，其生理功效具有协同增效的作用[12]。如黄芪多糖和硫酸化三枝九叶草多糖组成的复合多糖可以克服环磷酰胺诱导的免疫抑制，显著促进T淋巴细胞增殖，提高血清抗体滴度、IFN-γ、IL-2、IgG和IgM水平，其复合多糖效果优于单用黄芪多糖或硫酸化三枝九叶草多糖[13]；Wang等[14]将复合多糖（枸杞多糖:黄芪多糖:香菇多糖=1:1:1）灌胃幼鼠，构建了幼龄大鼠肠道菌群与代谢产物的相关网络，发现复合多糖被微生物利用后产生的代谢产物（如氨基酸和短链脂肪酸等）可促进益生菌丰度增加和肠道功能完善。复合多糖可增加肥胖小鼠肠道菌群中双歧杆菌属、别样棒菌属、苏黎世杆菌科等益生菌的数量[15]。龙眼、枸杞和红枣多糖的生理功效已被广泛报道，但对其调节益生菌的研究不多，其是否具有协同益生活性亦不明确。因此，本研究以南方特色水果龙眼、北方特色水果红枣和西北干旱地区经济作物枸杞为原料，通过对比三种多糖的理化性质和基本结构的差异，考察3种多糖单独及复合作用对益生菌增殖的影响，明确其是否具有协同益生功效。本研究的结果既可以丰富植物多糖生物活性的理论研究，又能为龙眼、枸杞、红枣功能性食品研发提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

龙眼干产地广东，品种为“储良”；红果枸杞干产地宁夏，品种为“宁夏枸杞”；红枣干产地新疆，品种为“灰枣”；以上三种原料购自天平架水果市场。

葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、岩藻糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸标准品均为色谱纯，上海源叶生物科技有限公司；葡聚糖标准品（分子量：1、5、12、25、150、270、410、670 ku）（色谱纯），美国Sigma aldrich公司；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成科技有限公司；复合益生菌株（发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热链球杆菌），厦门元之道生物科技有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

GL224I-1SCN分析天平，德国赛多利斯集团；SP902S可拆洗静音破壁机，浙江绍兴苏泊尔生活电器有限公司；Eyelan-1100旋转蒸发器、DRC-1000REC冷冻干燥器，东京理化器械株式会社；MRHei-Tec磁力搅拌器，德国海道夫集团；GL-20M高速冷冻离心机，湖南长沙易达仪器有限公司；BioTekGen5酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；WatersACQUITYAPC高效液相色谱仪，美国沃特世公司；ICS 5000高效离子色谱仪，美国Dionex公司；Nexus5DXC FT-IR傅立叶变换红外光谱仪，美国Nicolet公司；LEO1530VP场发射扫描电子显微镜，德国Zeiss公司；Malvern Zetasizer Series纳米粒度仪，英国Malvern仪器有限公司；LS-75HD立式压力蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗设备有限公司；SW-OJ-1F超净工作台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；HYQX-Ⅲ厌氧培养箱，上海跃进医疗器械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 多糖的提取

取龙眼干、枸杞干、红枣干原料洗灰去核，按料液比1:30（g/mL）的比例加入蒸馏水，打浆2 min直至果肉变成碎小颗粒，质地均匀，将果浆转移至5 L烧杯中，覆膜后置于95 ℃水浴浸提4 h，采用纱布趁热过滤，收集上清液，将滤渣按料液比1:30（g/mL）的比例加入蒸馏水二次提取，收集上清液合并，在65 ℃的水浴温度下旋转蒸发浓缩至原体积的1/5～1/4，得到粗多糖溶液。向粗多糖溶液中加入1/4体积的Sevag试剂（氯仿:正丁醇=4:1混合制得）去除蛋白，800 r/min磁力搅拌20 min后离心（4000 r/min，10 min），收集上清液，重复多次直至多糖溶液基本无蛋白沉淀，将上清液于65 ℃旋转蒸发去除有机试剂，得到脱蛋白多糖溶液。将脱蛋白多糖溶液加入4倍体积无水乙醇，于4 ℃冰箱存放12 h（静置过夜），冷冻离心（4000 r/min，20 min）收集沉淀，加少量预热蒸馏水溶解沉淀后，采用冷冻干燥得到三种多糖，分别标记为龙眼多糖（LP）、枸杞多糖（GP）和红枣多糖（JP）。

1.2.2 多糖基本成分分析

1.2.2.1 多糖得率

使用重量法计算多糖得率，计算公式如下：

1.2.2.2 基本化学成分

中性糖含量测定：采用苯酚-硫酸法[16]。

糖醛酸含量测定：采用Filisetti的间羟基联苯法[17]。

蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定蛋白含量。

1.2.2.3 分子质量

样品的配制方法：称取适量样品，加入1 mL流动相溶解，静置12 h，摇匀，过0.45 μm滤膜，等待分析。

葡聚糖标准品的配制方法：称取不同分子量的标准品各2 mg，加入流动相1 mL，静置12 h，摇匀，等待分析。

色谱柱：UltranhydrogelLinear（7.8×300 mm），柱温35 ℃；流动相：25 mmol/L Na2HPO4+25 mmol/L NaH2PO4+0.05% NaN3缓冲盐溶液；流速：0.8 mL/min；等度洗脱，进样体积：10 μL；检测器：示差折光检测器，温度35 ℃。

1.2.3 单糖组成分析

参考Zhang[18]的研究：5 mg样品加4 mL 4 mol/L三氟乙酸在安瓿瓶中溶解，酒精喷灯封管，在110 ℃条件下水解6 h。冷却到室温后旋转蒸发除去多余的三氟乙酸，加入3 mL甲醇复溶，蒸发干燥四次。最后，使用超纯水溶解残渣，定容到50 mL容量瓶后，过0.22 μm滤膜进行分析。

离子色谱条件：CarbopacPA1分析柱（250×4 mm2）；梯度洗脱过程如下：0～25 min，1% 500 mmol/L NaOH；25～40 min，线性梯度1～100% 500 mm NaOH；40～50 min，100% 500 mmol/L NaOH。用NaOH和CH3COONa洗脱葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。0～20 min，20% 500 mmol/L NaOH；20～30 min，100% 100 mmol/L NaOH和170 mmol/L CH3COONa，30～45 min，线性梯度20～35% 500 mmol/L NaOH。进样量为20 μL，柱温为30 ℃。结果根据单糖标准品的保留时间进行分析，并通过出峰的面积比计算出单糖摩尔百分比。

1.2.4 红外光谱分析

取1～2 mg多糖样品，与100 mg KBr研磨混合后压片，采用傅立叶变换红外光谱仪扫描分析，扫描范围为4000～400 cm-1。

1.2.5 扫描电镜分析

取2～3 mg多糖粉末，使其薄且均匀的分布在导电胶上，真空喷金，用扫描电子显微镜观察其在200和20000倍下的形貌特征。

1.2.6 多糖的溶液特性分析

多糖的溶解性测定：参考尹艳[19]的研究并稍作修改，称取200 mg的多糖样品，溶于4 mL蒸馏水中，室温下静置30 min，期间每隔5 min涡旋振荡10 s。静置后离心（4000 r/min，10 min），取上清液1 mL，冷冻真空干燥，称重干燥后的上清质量，以每毫升水中溶解的多糖的质量来表征其溶解性。

多糖溶液的粒径与电位测定：称取10 mg的多糖样品，溶于4 mL蒸馏水中，涡旋混匀后使用纳米粒度仪在25 ℃通过动态光散射分析多糖水溶液的Zeta电位（Zp）和粒度（Size）。

1.2.7 单一多糖对复合菌种的益生活性评价

无碳MRS液体培养基：蛋白胨10 g，酵母膏4 g，牛肉膏8 g，柠檬酸氢二铵2 g，无水乙酸钠5 g，七水合硫酸镁0.2 g，磷酸二氢钾2 g，四水合硫酸锰0.04 g，吐温801 mL，L-半胱氨酸0.5 g，加入1 L蒸馏水，调整pH为6.2～6.5。

菌株活化：将保存的复合益生菌株（发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热链球杆菌）溶于适量0.9%无菌生理盐水中制成菌悬液，取200 μL菌悬液接种到MRS液体培养基中，置于厌氧恒温培养箱（10% CO2、10% H2和80% N2，37 ℃）中培养24 h进行活化。取活化好的菌液继续传代培养。将传代培养至稳定期的菌液3500 r/min离心10 min，弃去上清液，用0.9%无菌生理盐水洗涤沉淀两次，最后加入10 mL生理盐水重悬菌体制成菌悬液备用。

试验设计：空白对照组、阳性对照组（菊粉和葡萄糖）、LP、GP和JP组，每组均设计5个浓度（1、5、10、20、30 mg/mL）。

按照4%（V/V）的接种量将制备好的菌悬液接种至以不同多糖样品和对照为碳源的培养基中，于37 ℃厌氧培养，培养48 h后取1.5 mL测培养液的pH值，另取2 mL培养液离心（5000 r/min，10 min），去除上层清液，沉淀用等量生理盐水重悬，以生理盐水为空白，在600 nm处测各组OD值，每个样品重复测定3次。采用比浊度法，以OD600值（反映溶液中细菌总数）为评价指标比较各多糖对益生菌增殖的影响作用。

1.2.8 正交试验优化三种多糖的最佳配比

表1 LP、GP和JP复合正交试验因素水平表Table 1 Factors level of orthogonal test for probiotic activity of LP, GP and JP

在单因素试验的基础上，选择10、20和30 mg/mL三个水平，以复合益生菌株在不同多糖配比下发酵48 h后的OD600值为考察指标，设计三因素三水平正交试验优化复合多糖最佳配比，试验因素水平安排见表1。单因素试验中得到多糖益生活性最佳浓度为30 mg/mL，确定复合多糖溶液最终浓度为30 mg/mL，培养方法及检测指标参考1.2.7。

1.2.9 统计分析

每个试验重复3次，通过SPSS 19.0.0软件分析数据，并用Duncan检验比较组间差异，以不同小写字母表示（p＜0.05）。结果以均数±标准差（¯x±s）表示，采用Origin 9.0和Excel软件制表作图。

2 结果与讨论

2.1 多糖基本成分

3种多糖的得率、分子量和基本化学组成见表2。JP的得率最高为4.07%，LP和GP的得率分别为1.59%和1.84%，并无显著性差异（p＞0.05）。3种原料多糖的得率与前人研究基本一致，如本课题组前期研究的龙眼多糖得率为1.06%～8.58%[20,21]，文献报道枸杞多糖得率为0.35%～14.12%[22,23]，红枣多糖得率为2.30%～8.01%[24,25]。多糖的得率与原料品种、来源，以及提取方式等都有密切关系。

LP和JP的纯度相对较高，含有一个分子量峰，GP的纯度相对较差，含有2个分子量峰[26]。3种多糖主峰分子量大小为：JP＞GP＞LP。3种多糖主要由中性糖和糖醛酸组成，含有少量的蛋白质。三种多糖的中性糖含量为：LP＞JP＞GP，且均超过70%。GP的糖醛酸含量显著高于LP和JP（p＜0.05），而JP的蛋白质含量显著高于LP和GP（p＜0.05）。

表2 LP、GP和JP的得率、分子量和化学成分Table 2 Yield, molecular weight and chemical composition of LP, GP and JP

2.2 多糖的单糖组成

LP、GP和JP的单糖组成见表3。3种多糖含有5种中性糖、2种糖醛酸，且均以中性糖为主。LP和GP的单糖组成比较相似，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖组成，JP则主要由葡萄糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖组成。3种多糖中含量最高均为葡萄糖，其比例超过50%。3种多糖的单糖组成与前人报道的龙眼多糖、枸杞多糖和红枣多糖的结果相似[27-29]。

表3 LP、GP和JP的单糖组成（摩尔比）Table 3 Monosaccharide composition of LP, GP and JP

2.3 多糖的红外光谱

3种多糖的红外光谱吸收峰见图1。LP、GP和JP在3600～3200 cm-1均出现了强吸收峰，是糖类分子之间或分子内的O-H伸缩振动峰[30]；2931 cm-1处的吸收峰为甲基或亚甲基C-H键伸缩振动吸收峰；1103 cm-1、1078 cm-1、1052 cm-1和1030 cm-1处的吸收峰是α型吡喃糖苷的C-O-C伸缩振动特征吸收峰[31]，由这三组糖类的特征峰可以判断，LP、GP和JP是多糖。801 cm-1处的吸收峰由呋喃环的C-H变角振动引起的，865 cm-1和923 cm-1处的吸收峰表示含有呋喃糖环结构。1614 cm-1、1420 cm-1为C=O伸缩振动特征吸收峰，表明羧基的存在；1261 cm-1处的吸收峰为羧基-COOH的O-H变角振动；1371 cm-1处的吸收峰是-COOH中C=O对称伸缩振动引起的，表明3种多糖均为酸性多糖。红外光谱结果表明3种含有典型的多糖结构特征官能团，且均为酸性多糖，与其单糖组成结果一致。

图1 LP、GP和JP的红外光谱图Fig.1 FT-IR spectra of LP, GP and JP

2.4 多糖的微观形态

3种多糖不同放大倍数的扫描电镜图如图2所示。3种多糖的微观结构有显著差异。在低倍率下（×200），LP为碎片化聚集体；GP呈片状，碎屑化堆积形态；JP则为网状结构。在高倍率下（×20000），LP表面相对光滑，且有少量分散体缠绕；GP表面形貌呈干燥褶皱状；JP表面光滑，有少量凹凸不平。

图2 LP、GP和JP的扫描电镜图Fig.2 SEM images of LP, GP and JP

2.5 多糖的溶液特性

3种多糖的溶解性、粒径、粒度分散指数（PDI）和Zeta电位结果见表4。三者的溶解性并无显著性差异（p＞0.05），均在40 mg/mL以上。3种多糖的粒径大小为：JP＞LP＞GP。PDI反映的是粒径分布的均匀程度，PDI值越大表明分布越不均匀[21]。三种多糖的PDI大小为：GP＞LP＞JP，表明GP分布最不均匀。Zeta电位反映多糖在溶液中的带电情况，其电位绝对值越大，表明其在溶液中越稳定[32]。3种多糖的Zeta电位都是带负电，表明其均为阴离子多糖；3种多糖电位的绝对值大小为：JP＞LP＞GP，表明JP最稳定，GP最不稳定。这与GP含有2个分子量峰结果一致，表明其不均匀性。

表4 LP、GP和JP溶解性、粒径、粒度分散指数与Zeta电位Table 4 Solubility, particle size, particle size dispersion index and Zeta potential of LP, GP and JP

表5 各碳源对复合益生菌株增殖的影响Table 5 Effects of various carbon sources on the proliferation of compound probiotics

表6 各碳源对复合益生菌株产酸的影响Table 6 Effects of various carbon sources on acid production of compound probiotics

2.6 单一多糖的益生活性

3种多糖对复合益生菌株增殖作用的结果见表5。由此可知，3种多糖对复合益生菌株的增殖有促进作用。对于同一种多糖而言，随着多糖浓度的增加，其培养基的OD600值呈增大的趋势，说明多糖的增殖效果随其浓度的增加而增加，在多糖浓度为30 mg/mL时增殖效果最好。对于不同多糖而言，在相同浓度下，各碳源培养基OD600值整体趋势为：JP≈GP＞LP＞菊粉＞葡萄糖＞空白对照组（无碳源），但在低浓度下（1 mg/mL）JP组的OD600值高于GP组，在高浓度下（20和30 mg/mL）菊粉组和LP组的OD600值相当，说明3种多糖对复合益生菌有显著的促进增殖效果，其效果优于菊粉和葡萄糖；JP和GP的益生活性相当，均比龙眼多糖好。不同益生元的聚合度、单糖组成、支链结构都会对其益生活性产生影响[33]，3种多糖因其理化特性不同，因而表现出不同的益生活性。

糖类物质可被益生菌作为碳源酵解利用，代谢产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸以及乳酸等，这些有机酸会导致培养基pH降低，因此，可以通过测定培养基pH值间接判断益生菌生长状况。从表6可以看出，对于同一种多糖而言，随着其浓度增加，液体培养基的pH值显著减小，在30 mg/mL的添加量下pH值达到最小。对于不同多糖而言，在相同浓度下，3种多糖培养基pH值大小为JP＜GP＜LP，这与OD600值的变化结果相符。菊粉组和LP组在实验浓度范围内各浓度下pH值都无显著性差异。葡萄糖组pH值是所有碳源组中最高的。Ji等[34]推测多糖的单糖组成影响其被肠道微生物酵解利用，如多糖中的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和甘露糖等单糖更容易被肠道微生物利用；本课题组研究发现多糖中的葡萄糖的相对含量越高，其益生活性越强；具有网状结构的多糖，更易于被微生物分泌的碳水化合物活性酶分解利用[35,36]，这与本研究的结果一致。

2.7 三种多糖的最佳配比

正交试验优化LP、GP和JP复合配比的结果及方差分析见表7和表8。由表7可见，3种多糖对复合益生菌增殖的影响大小为LP＞JP＞GP，复合多糖的最佳配方为A2B3C1，即LP:GP:JP=2:3:1，该最佳配比形成的复合多糖作用于复合益生菌48 h后，其OD600值最大为3.29。在表8方差分析中，LP对OD600值影响极其显著（p＜0.01），因素JP对OD600值影响不显著（p＞0.05），因素GP可归为误差，这与极差分析的因素主次结果一致。

进一步比较最佳配比形成的复合多糖与各单一多糖在相同浓度下对复合益生菌增殖和pH的影响，结果如图3所示，在30 mg/mL的浓度水平上，复合多糖促进复合益生菌株增殖的效果显著高于单一多糖及葡萄糖和菊粉对照组（p＜0.05），其对应培养基的pH值显著低于单一多糖和其他对照组（p＜0.05）。由此表明，LP、GP和JP多糖经复合后，具有显著的协同益生增效作用。分析3种多糖具有协同增效的原因，可能与其结构以及对不同益生菌的影响不同有关。前人研究报道龙眼多糖能促进发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌等益生菌增殖表现出益生活性[35]，而枸杞多糖可显著促进长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳酸杆菌保加利亚亚种等益生菌增殖[14,37]，红枣多糖则促进发酵乳酸菌和双歧杆菌等益生菌增殖[38,39]。由此可见，3种多糖对不同益生菌的影响效果是不同的，因此3种多糖的复合多糖对复合益生菌的促增殖效果会显著强于单一多糖。

表7 试验方案和极差分析结果Table 7 Test scheme and range analysis results

表8 正交试验的方差分析表Table 8 Variance analysis table of probiotic activity

图3 各碳源对复合益生菌株增殖（a）和产酸（b）的影响Fig.3 Effects of various carbon sources on the proliferation (a) and acid production (b) of the compound probiotics

3 结论

比较龙眼多糖、枸杞多糖和红枣多糖的理化性质和益生活性差异，发现红枣多糖得率最高、分子量最大；枸杞多糖的中性糖含量最低、糖醛酸含量最高；龙眼多糖的分子量最小、中性糖含量最高；3种多糖的微观结构有显著差异，枸杞多糖在溶液中最不稳定、红枣多糖最稳定；3种多糖单独作用时均能显著促进益生菌增殖，经复配后其益生活性显著增强，最佳的复配比为龙眼多糖:枸杞多糖:红枣多糖=2:3:1。有关三种多糖协同作用的机理有待进一步研究。本研究可丰富植物活性多糖的理论基础，又可为龙眼、枸杞、红枣的精深加工提供理论依据。