基因转染技术在抗肝纤维化中应用的研究进展▲

艾丁丁 罗伟生

(广西中医药大学脾胃科，南宁市 530000，电子邮箱:378621449@qq.com)

【提要】 基因治疗是指将外源性正常基因导入靶细胞以治疗疾病的一种方法，现阶段主要运用于肿瘤及某些特殊疾病的治疗。有研究显示，将基因治疗的转染技术用于抗肝纤维化的治疗可以逆转纤维化，或可成为治疗肝纤维化的潜在方案。本文就基因转染技术在抗肝纤维化中应用的研究进展进行综述。

肝纤维化是肝炎发展到肝硬化、肝癌的中心环节，在肝纤维化过程中，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的增殖与抑制是逆转肝纤维化的关键。而肝纤维化既是一个病理进展过程又是一个可逆性疾病，同时存在于慢性肝病发生、发展和修复的过程中。通过转染技术干预HSC细胞的增殖来抑制肝纤维化，是近年来治疗肝纤维化疾病的新方向。本文就基因转染技术用于肝纤维化治疗的研究进展做一综述。

1 基因治疗的概述

基因治疗是一种将同种健康遗传分子物质导入患者细胞以取代异常基因的新型治疗方法，属于非常规治疗手段，其通过改变病体原有的基因产物以达到目的基因产物正常化的目的。治疗过程主要是借助必要的载体将遗传物质导入有缺陷的组织或细胞的指定位置，使其产物对相应基因进行矫正、置换或增补，以预防或治疗某种疾病[1]，其中，基因转染技术是基因治疗的一种方法，也是影响治疗效果的关键[2]。

2 转染技术的概述

基因转染技术是一种将遗传物质定向、定点传输入靶目标生物体的方式，转染技术能使遗传信息得到高效的、完整的保存和应用，是基因治疗的关键。主要分为病毒感染法和非病毒转染法，非病毒转染法中的基因转染因操作简便而更为常用，但病毒仍是最常见的基因治疗导入载体。

2.1 病毒感染方法 根据载体的特点病毒感染方法可分为逆转录病毒载体法和慢病毒载体法。近年来，慢病毒载体法成为基因治疗研究的热点，如何提高转染的稳定性、普适性和转染率是学者们关注的焦点。

2.1.1 逆转录病毒载体法：RNA病毒是逆转录病毒载体法的主要载体，在逆转录下以单链RNA载入病毒后形成双链DNA，最终整合为原病毒。逆转录病毒载体易于制备，Kang等[3]的实验研究表明，慢病毒介导的CNN2shRNA转染到SK-hep-1细胞后对细胞表达的蛋白进行定向修饰，能有效抑制肿瘤细胞的增殖。但逆转录病毒(RNA病毒)的病毒载量小、转化效率低，使逆转录病毒载体法的应用受限，因此，如何提高转化效率是目前有待攻克的技术性难题。

2.1.2 慢病毒载体法：慢病毒载体法主要是以腺病毒相关病毒为主要载体，具有转染率高、靶向性好等优势，其在基因治疗肿瘤中的应用已成为近年来的研究热点。Doggybone DNA(dbDNA)是一种新型DNA，其适配的功能性的慢病毒载体可以用于体内外的遗传信息传递，但以此法制作的慢病毒载体成本较高，因此，大量高质量DNA的生产仍然是基因治疗中病毒载体生产的主要瓶颈[4]。

2.2 非病毒转染方法 非病毒载体法是指用化学、物理或生物方法将正常基因导入靶细胞的方法[5]，该方法操作相对简单，有较高的转染率，比较适合初学者。有学者研究发现，阳离子脂质体载体的微循环DNA复合体可以在保持原有细胞活力的前提下提高视网膜原代细胞和大鼠视网膜细胞的转染率[6]。非病毒转染法主要包括化学、生物和物理转染法。

2.2.1 化学转染法:化学转染法主要有阳离子法、磷酸钙共沉淀法和脂质体转染法，其中磷酸钙共沉淀法仅用于实验性基础研究的开发。Reinhard等[7]采用阳离子脂质低聚物进行转染实验时发现，优化裂解方案可以最大限度地减少三氟乙酸加合物的形成，从而提高合成的效率。因化学转染法的转染率低而运用受限，但与其他方法联合使用可提高活体内的转染率，如将化学转染法和物理转染法合并使用的TurboFect试剂转染联合机械转导联合转染方法,能有效增强肿瘤细胞中的基因载体传递[8]。

2.2.2 生物、物理及其他转染方法:近年来，非病毒转染方法中的生物和物理转染法较为常用，其中受体介导的基因转移法和直接注射法是近期研究的热点。生物转染法中，受体介导的基因转移法使用的质粒DNA与载体形成的复合体大多能被肝脏摄取，因此该转染法更适用于慢性肝病的转染治疗，但该复合体在活体内持续表达的时间较短导致该转染法使用受限。最新研究表明，引入基因治疗增强剂可以增强生物材料支架系统的传递潜力，如活化的聚酰胺酰胺树状大分子转染试剂配合特定的复合支架可用于各种组织缺陷的再生治疗[9]，这使得生物转染法的应用取得新的进展。物理转染法较为直接，如显微镜注射法是在显微镜下利用外源性基因直接注射入细胞，该方法适合靶基因在肌肉、肝脏和脾脏等细胞中的表达培养，如基于纳米通道阵列平台进行细胞培养的基因治疗[10]。

3 基因转染技术在肝纤维化中的应用

随着基因转染技术的逐渐成熟化，该技术在肝纤维化、肝硬化和肝癌等慢性肝病中的治疗成为可能。目前，将基因转染技术应用于抗肝癌或抑制肝纤维化是基因转染技术在慢性肝病研究中应用的首要突破口。而寻找活体内的可行性、最高效的基因转染关键靶点是提高基因转染治疗效果的关键。有研究显示，暂时性胆道阻塞可以提高基因转染治疗的效果，并且肝胆道可能是基因治疗的重要给药部位[11]。

3.1 基因转染调控蛋白抗肝纤维化 Xu等[12]成功构建重组pIRES2-EGFP-ARTS质粒并将其转染入活化的人LX-2 HSC，结果显示ARTS过表达可能是潜在的逆转肝纤维化的新型治疗手段，使基因转染治疗肝纤维成为可能。有研究显示，丙型肝炎病毒蛋白具有多种调节细胞死亡的机制并可促进细胞自噬，该发现可能使丙型肝炎病毒蛋白成为预防或治疗丙型肝炎病毒相关肝纤维化、肝硬化或肝癌的病理靶标[13]。在小鼠肝纤维化模型中，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)-30a过表达后可直接抑制Beclin1介导的细胞自噬来预防肝纤维化，miRNA-30a成为潜在的抑制肝纤维化发展的新靶点[14]。由此可见，基因转染技术主要通过调节某些分子机制来改变上游蛋白的表达，从而直接逆转肝纤维化的发展，并通过相关信号通路间接抑制肝肿瘤细胞的增殖。

3.2 基因转染调控HSC活化抗肝纤维化 HSC是肝纤维化发生发展的关键环节，细胞本身的活化和抑制是防治肝纤维化的关键，目前，免疫调节剂、受体等对HSC的调节成为基因治疗肝纤维化的研究热点。核苷酸结合寡聚化域样受体5是寡聚化域样受体家族的最大成员，被确定为能够影响肝纤维化发展的免疫反应关键调节剂，因此，寡聚化域样受体5或可通过调节逆转录过程HSC活化蛋白的差异表达来逆转肝纤维化[15]。有研究显示，腱生蛋白C是一种细胞外基质糖蛋白，其在肝纤维化过程中表达上调，并且随着HSC的激活其表达水平升高，而给予过表达的pTARGET-腱生蛋白载体转染后，HSC的活化有所增强[16]。有研究表明，相关蛋白是人体重要的功能性下游蛋白，其在活化的HSC中表达降低有助于获得HSC的静止表型，且其可能是HSC活化和逆转肝纤维化的新标靶途径[17]。还有研究显示，miRNA-942靶向过氧化物酶体增殖物激活受体γ能降低人肝纤维化中HSC的活化[18]。因此，采用基因转染方法调节过氧化物酶体增殖物激活受体γ表达可能是治疗慢性乙型肝炎性肝纤维化的新策略。

3.3 基因转染调控信号通路抗肝纤维化 近年来，有学者采用基因转染技术对信号通路进行调控来抗肝纤维化，如采用基因转染技术对转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)信号通路、经典的Wnt信号通路和Smad3经典信号转导途径等与生长和发育相关的重要信号通路进行干预。有研究表明，miRNA-29b与TGF-β1/Smad3信号通路之间的反馈环是一种恶性循环，而miRNA-29b对TGF-β1诱导的LX-2细胞(人类HSC细胞)活化具有抑制作用，因此，对此反馈环进行负向调节可能是抗肝纤维化的方法之一[19]。还有研究显示，移植uPA基因修饰的骨髓间充质干细胞可以抑制被CCL4诱导的肝纤维化大鼠的肝纤维化、改善肝功能，其可能成为治疗肝纤维化的一种新方法[20]。Notum(一种新发现的蛋白抑制剂)通过下调Wnt5a介导的非经典途径也可以抑制乙型肝炎病毒诱导的肝纤维化[21]。以上文献提示，采用基因转染技术对常见的信号转导途径进行干预均可抗肝纤维化，但相关研究结果在临床上应用还需要大规模、多样本的临床研究结果支撑。

3.4 基因转染保护肝细胞发挥抗肝纤维化作用 肝细胞凋亡是许多肝脏疾病发生、发展的主要特征之一，而保护肝细胞并抑制其凋亡的主要作用是改变肝细胞的自身状态，如降低肝细胞的基础代谢，改变细胞外基质对肝细胞的作用。研究证实，采用染色体10上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物腺病毒进行基因治疗或为抗肝纤维化的治疗方法之一[22]。另有研究显示，靶向法尼醇X受体可抑制肝纤维化中肝细胞的凋亡[23]，这使得临床利用基因转染技术抑制肝细胞凋亡与衰老从而抗肝纤维化成为可能。通过细胞外基质调节干扰素信号传导和HCV-RNA的复制可减少肝纤维化物质的累积[24]，据此或可研发一种抑制并逆转肝纤维化发展的新药物。

总之，采用基因转染技术保护肝细胞或为临床最直接、最简单的抑制肝纤维化进程的途径，而从细胞内环境和细胞代谢等方面保护肝细胞，是未来研究的新方向。

4 小 结

目前，基因治疗技术发展迅速，尤其是基因转染技术在多学科交叉层次的研究逐渐深入，其在肝脏疾病的诊断和治疗方面也取得一定成效，转染技术在抗肝纤维化治疗中的用药靶点和信号通路机制研究均有突破性进展。但基因转染技术也有其局限性，如非病毒转染法存在转染率低的问题，将来还需进行多方面的基础实验研究以提高基因转染技术的转染率。