常见矿物基础油的急性生态毒性评价*

李 铮，王顺祥，2，方建华，谷科城，吴兆杰

（1.陆军勤务学院，重庆 401331；2.中国地质调查局 应用地质研究中心，四川 成都610036）

发光细菌是一种非致病性的兼性好氧生物，革兰氏染色呈阴性，多分布于海水中，与海洋中发光蜉蝣生物相似，能够引起海面的发光。目前，国内外已经命名的发光细菌属[1]主要有：发光异短杆菌属、发光杆菌属、希瓦氏菌属、弧菌属。我国常用其中3 种发光细菌分别是发光杆菌属中的明亮发光杆菌、弧菌属中的青海弧菌和费氏弧菌，其中明亮发光杆菌和费氏弧菌都为海洋细菌，而青海弧菌为淡水细菌。

发光细菌产生的可见荧光实际上是生物本身的一种代谢过程。在正常情况下，活菌体内含有荧光酶、三磷酸腺苷（ATP）以及黄素单核苷酸等发光要素。发光细菌在进行新陈代谢过程中，在有氧以及细胞内荧光酶的催化条件下，能把还原态的黄素单核苷酸（FMNH2）和脂肪醛类物质同时转化为荧光素（FMN）和脂肪酸类物质，同时释放出可见蓝绿色荧光。其反应过程如下：

发光细菌在进行发光过程中极易受到外界的干扰，特别是当存在毒性物质时，会直接抑制荧光酶的活性或者干扰发光细菌的代谢过程[2]，因此，在一定条件下，利用发光细菌的发光程度可以检测到物质的毒性强弱。目前，国内已经将发光细菌法测急性毒性试验广泛应用于农药污染和水质污染等各种环境检测中[3,4]。

本文参照国内外相关文献以及标准[5-7]，利用发光细菌法对矿物基础油的急性生态毒性大小作了评价。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

选用我国润滑油生产过程中常用的12 种矿物基础油为研究对象，进行急性生态毒性评价。矿物基础油有以下几种：I 类矿物基础油：150SN、400SN、600SN；II 类矿物基础油：150N、400N、26 号中间基、680 号中间基、KN4006、KN4008、KN4010；III 类矿物基础油：150N、400N，均由深圳市华美特润滑科技有限公司提供。

NaCl、ZnSO·47H2O 均为分析纯，成都市科龙试剂厂；发光菌冻干粉（Vibrio fischeri，NRRL B-11177，浙江托科司生物技术有限公司）。

微孔板型多功能检测仪（Glomax Multi，Promega Co）；细胞培养板（96 孔，Corning/Costar Co）；85-2 型数显恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；BL22-500A 型超声波清洗器（上海比郎仪器公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 费氏弧菌的复苏 称取30g NaCl 倒入烧杯中，溶解后倒入1L 容量瓶中，然后加入超纯水定容至1L，得3% NaCl 溶液，储存备用；称取20g NaCl倒入烧杯中，溶解后倒入1L 容量瓶中，然后加入超纯水定容至1L，得2% NaCl 溶液，储存在4℃冰箱备用。将保存在-20℃冰箱中的一支费氏弧菌发光细菌冻干粉的安瓿瓶和冷的2% NaCl 溶液取出，放入含有冰块的烧杯中，用注射器取1.0mL 的2% NaCl 溶液注入发光细菌安瓿瓶中，摇动安瓿瓶，确保混合均匀，复苏等待10min 至发光稳定，并且发光强度要达到100 万光子数，此时表明菌液合格，否则重新更换复活菌液。

1.2.2 样品前处理方法 为了模拟自然生态环境中油品对水域的典型污染状况，通过制备基础油的水融合部分WAF 来测定急性毒性，以采用半数效应载荷率（Effect Load 50, 简称EL50）作为急性生态毒性的评定参数[8]。其中EL50指的是能引起一半响应生物的某种效应发生变化的溶液中试验材料的负载率（加入的难溶物质质量与溶液介质体积之比）。该前处理方法获得的测试数据可作为多组分供试物的整体毒性数据来使用[9]，有学者已经将此法用于鱼类和藻类等水生生物的生态毒性试验[10]。

本文选用费氏弧菌作为受试生物。费氏弧菌是海洋细菌，研究表明，在土壤石油污染及其毒性评价中，费氏弧菌对比明亮发光杆菌和青海弧菌，复活能力更好，发光性能更稳定、且污染响应值更宽。由于费氏弧菌属于海洋发光细菌，因此，本文制备WAF溶液均采用含有3% NaCl 的超纯水作为其水溶液。制备WAF 过程中，搅拌的细节等对溶液的影响很大。首先，搅拌的速度需控制好，保证溶液旋涡深度为试液高度的10%~30%，因此，数显恒温加热磁力搅拌器设置搅拌速度在800~1200r·min-1范围内，此时旋涡深度合适；其次，为了保证油品和NaCl 溶液充分混合并且保证有足够的接触时间，需要确定适当的搅拌时间，随着搅拌时间加长，溶液中油品含量增加，但是增量会渐渐平缓达到饱和。根据Girling,A E 等人对于石油产品水生生物毒性测试的一些建议和实际经验表明[11]，通常搅拌24h，静置沉淀1h，就可以实现这一目标。综合以上因素，本文WAF 制备条件设置为：温度25℃，搅拌速度设置为900r·min-1，搅拌时间24h，然后静置沉淀1h。

1.2.3 试验操作步骤

1.2.3.1 制备WAF 溶液 将1L 3%的NaCl 溶液倒入2.5L 龙头瓶中，再从溶液顶部缓慢倒入待测油品；然后在容器上盖上箔纸或非反应的覆盖物，在搅拌速度为900r·min-1条件下开始搅拌24h，充分混合使待测物质在溶液中尽量溶解或者均匀分散，旋涡深度为试液高度的10%~30%，目的是防止乳化；搅拌完成后静置1h；静置结束后，将溶液从容器底部倒出，从底部倒出的前10mL 溶液弃用，取接下来的100mL 溶液即得到一定载荷率的WAF 溶液，毒性测定在取得WAF 溶液后6h 内进行。

1.2.3.2 发光度的测定 本文测试发光细菌发光度采用的是Glomax Multi 型微孔板型多功能检测仪，该仪器适用于多样品同时全自动检测，检测速度快，节省试剂，检测功能多。在使用仪器前，先进行仪器预热：打开仪器电源，预热大约15min，保持室内温度25℃。取复苏后的发光菌液1mL，用2% NaCl 溶液稀释到40mL，备用。

对润滑油组分等难溶性混合物，其在溶液中溶解以及分散程度有限，随着溶液载荷率增大到一定值时，会达到饱和态，不同种类油品载荷率达到饱和态时是不同的，为了使各种油品的WAF 溶液均能达到饱和态，在对基础油或添加剂进行前处理时，最高载荷率定为10000mg·L-1。首先，进行预实验，配制1、10、100、1000、10000mg·L-1的样品 WAF 溶液，每个样品设置三个平行，同时设置96 孔板第一行设置为阴性质控，第二行为阳性质控。各孔中加入样品液180μL 和菌液 20μL，总体积为 200μL。放入仪器进行测试，以此为样品初始发光强度记做S0；记录阴性质控（2% NaCl） 初始发光强度为C0；阳性质控（10mg·L-1ZnSO4）当做样品处理。设置 15min 的反应时间，然后，使用微孔板型多功能检测仪测定受试样品中发光菌的发光强度，记录15min 时间，阴性质控初始发光强度为Ct；样品发光强度记做St；阳性质控当做样品处理，初始发光强度记做Pt。如果样品溶液载荷率在达到10000mg·L-1时，发光抑制率小于50%，基本上就不会出现EL50，判断样品为无毒；如果样品溶液载荷率在10000mg·L-1时发光抑制率大于50%，选择抑制率合适的浓度范围设计成为6 个浓度梯度，再参照预实验流程进行测试，用Origin 拟合曲线计算出EL50值。

1.2.3.3 数据处理

（1）校正系数（Cf值） Cf值是指阴性样品在测试时间段内（15min），菌液相对发光强度的变化，即表明菌液的稳定性，计算方法如下：

（2）有效性实验结果须满足以下有效性参数：

①样品测试15min，Cf值需在0.6~1.8 区间（含0.6 和 1.8）；

②测试时，阴性质控中菌液的最终浓度需不小于106光子数；

③样品平行测试时，变异系数（标准偏差与平均值之比）CV%≤3%；

④阳性质控测试15min 后，发光抑制率应达到50%左右。

（3）抑制率计算 抑制率又可以称为光损失率（IR），计算公式如下：

1.2.4 急性生态毒性分级方法 根据Bulich（发光细菌测试仪发明者）的生物发光毒性检测效应分级标准、中科院南京土壤研究所提出的百分数急性生态毒性分级标准以及一些润滑油急性毒性评定的相关数据，以半效应载荷EL50值为指标，确定本文中矿物基础油和润滑添加剂的急性生态毒性分级方法，见表 1[11]。

表1 急性生态毒性分级方法Tab.1 Acute eco-toxicity grading method

1.2.5 试验方法的稳定性分析

采用上述方法对I 类 150SN、II 类 400N 以及KN4006 基础油进行急性毒性评价，考察该方法的稳定性。分别进行3 组平行试验（编号1,2,3），结果见表2。

表2 发光细菌法测定急性毒性结果Tab.2 Determination results of Luminescent bacteria test

由表2 可知，平行试验最大偏差在130mg·L-1之内,I 类150SN 和II 类400N 急性毒性结果均为微毒，KN4006 基础油均为低毒，试验结果的相对误差均在2%以内，急性中毒过程是一个很复杂的生化反应，需要采用有效且适合的方法才能够客观评价出来，从以上分析结果看出，该试验方法得出的结果具有良好的稳定性，可用于难溶油品的急性毒性评价。

2 结果与讨论

2.1 I 类矿物基础油的急性生态毒性结果与分析

3 种I 类矿物基础油在载荷率为10000mg·L-1时，150SN、400SN 和 600SN 的发光抑制率分别为66.5%、78.6%、78.5%，均大于50%，分别配制载荷率为 1000、2000、4000、6000、8000、10000mg·L-1的 WAF溶液进行发光度测试得到发光抑制率大小随WAF溶液载荷率的变化曲线，见图1。

图1 I 类矿物基础油发光抑制率结果Fig.1 Luminous inhibition rate of type I mineral base oils

由图1 可知，随着溶液载荷率的增大，对发光度抑制率在增加，表明毒性就越大。数据经过Origin 处理，得出拟合曲线公式如下：其中Y 为抑制率，%；X为 WAF 载荷率，mg·L-1，相关系数 R2均达到 0.99 以上：

（1）150SN 发光抑制率变化公式：

（2）400SN 发光抑制率变化公式：

（3）600SN 发光抑制率变化公式：

经拟合曲线公式计算得出，3 种矿物基础油的EL50值分别为 5758.9、4729.7、2903.1mg·L-1。因此，150SN 的急性生态毒性等级为微毒，400SN 和600SN 为低毒。3 种I 类矿物基础油的急性生态毒性不大，毒性从小到大排序为150SN<400SN<600SN。

2.2 II 类矿物基础油的急性生态毒性结果与分析

当载荷率为 10000mg·L-1时，II 类 150N、II 类400N、26 号 白 油 、680 号 白 油 、KN4006、KN4008、KN4010 的发光抑制率分别为60.5%、73.4%、42.5%、88%、72.3%、85.2%、91.7%。分别配制载荷率为1000、2000、4000、6000、8000、10000mg·L-1的 WAF 溶液进行发光度测试得到发光抑制率大小随WAF 溶液载荷率的变化曲线，见图2。

图2 II 类矿物基础油发光抑制率结果Fig.2 Luminous inhibition rate of type II mineral base oils

由图2 可知，其中26#白油在最高载荷率时抑制率为42.5 %，小于50 %，且随着载荷率的增加，抑制率基本上趋于一个常数，可以判定其急性生态毒性不会出现EL50值。其它6 种II 类基础油随着溶液载荷率的增大，对发光度抑制率在增大。数据经过Origin 处理，得出拟合曲线公式如下，其中Y 为抑制率，%；X 为 WAF 载荷率，mg·L-1，相关系数 R2均达到0.99 以上：

（1）II 类150N 发光抑制率变化公式：

（2）II 类400N 发光抑制率变化公式：

（3）680 号白油发光抑制率变化公式：

（4）KN4006 发光抑制率变化公式：

（5）KN4008 发光抑制率变化公式：

（6）KN4010 发光抑制率变化公式：

经拟合曲线公式计算得出，II 类150N、II 类400N、680 号 白 油 、KN4006、KN4008、KN4010 的EL50值分别为 7081.1、5540.5、2090、4270.3、3387.4、2010.1mg·L-1。根据急性生态毒性分级方法，II 类150N 和II 类400N 毒性等级属于微毒，680#白油、KN4006、KN4008 和 KN4010 属于低毒，26#白油属于无毒。总体看来，这7 种II 类矿物基础油毒性不大，对生态环境急性毒性危害较小。

2.3 III 类矿物基础油的急性生态毒性结果与分析

当载荷率为 10000mg·L-1时，III 类 150N 和400N 的发光抑制率分别为38.6%、64%。分别配制载荷率为 1000、2000、4000、6000、8000、10000mg·L-1的WAF 溶液进行发光度测试得到发光抑制率大小随WAF 溶液载荷率的变化曲线，见图3。

图3 III 类矿物基础油发光抑制率结果Fig.3 Luminous inhibition rate of type III mineral base oils

由图3 可知，其中III 类150N 在最高载荷率时抑制率为38.6%，小于50%，且随着载荷率的增加，抑制率基本上趋于一个常数，可以判定其急性生态毒性不会出现EL50值。III 类400N 随着溶液载荷率的增大，对发光度抑制率在增大，数据经过Origin 处理，得出拟合曲线公式如下，其中Y 为抑制率，%；X为 WAF 载荷率，mg·L-1，相关系数 R2达到 0.99 以上：

Ⅲ类400N 发光抑制率变化公式：

经拟合曲线公式计算得出，III 类400N 的EL50值为6459.5mg·L-1。根据急性生态毒性分级方法，III类150N 毒性等级属于无毒，III 类400N 毒性等级属于微毒。

3 机理探讨

通过对12 种矿物基础油急性生态毒性分析，结果见表3。

表3 发光细菌法检测矿物基础油的急性毒性结果Tab.3 Acute toxicity of mineral base oils detected by luminescent bacteria method

由表3 可知，12 种矿物基础油急性毒性均较低。其毒性机理可能有以下两个方面：（1）物理隔离，由于WAF 溶液中可能含有细小油滴，直接与费氏弧菌接触后隔离氧分子，阻止了代谢过程，造成发光度降低；（2）矿物油自身毒性，有毒物质通过细胞膜交换后进入细胞，对细胞造成破坏或降低荧光酶活性，从而影响发光度。虽然矿物基础油急性毒性较低，但有研究表明，需要特别注意其生物蓄积性，比如有的矿物油在大鼠身体中积累可形成微小肉芽肿，有的含芳烃类矿物油具有致畸致癌性[12]。

4 结论

参照国内外文献及标准，利用发光细菌法测定矿物基础油的急性生态毒性。该方法选用费氏弧菌为受试生物，通过制备水融合部分（WAF）方法对样品进行前处理，以半数效应载荷率（EL50）作为急性毒性评定参数，这对于油品等难溶性物质的毒性判断更科学易行。结果表明，该方法相比于鱼类、海藻和水蚤等急性毒性试验，大大缩短了试验周期，并且具有稳定性良好、简便、快速、成本低等特点，测试结果可为油品污染的监测以及环境可接受润滑油的研究提供一些基础数据。

利用该方法检测出了12 种常用的矿物基础油的急性生态毒性大小，并进行了毒性分级。常用的12 种矿物基础油的急性毒性都较低。试验结果用Origin 统计绘图，发现通常情况下矿物基础油的WAF 溶液载荷率与其发光抑制率呈现出指数递增关系，可用以下公式表示，其相关系数达到0.99 以上：

式中 Y：抑制率，%；X：WAF 载荷率，mg·L-1；A、t、Y0：常数。