防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭作用机制的网络药理学探讨

胡晓玲，付 蓉，苏治福

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各种心脏结构或功能异常导致心室充盈和(或)射血能力受损，心排血量不能满足机体组织代谢需要，以肺循环和(或)体循环淤血，器官、组织血液灌注不足为临床表现的一组临床综合征，主要表现为呼吸困难、活动耐量受限和体液潴留[1-3]。中医药在慢性心力衰竭治疗上有一定优势。《金匮要略》记载防己黄芪汤可治疗慢性心力衰竭，其方由防己、黄芪、白术、甘草、生姜、大枣6味中药组成，具有益气祛风、健脾利水之功效，适用于心悸、气短、乏力、咳喘、舌质淡或边有齿痕、脉沉细或虚数的心肺气虚证病人[4]。但防己黄芪汤的化学成分复杂[5]，在慢性心力衰竭治疗中发挥的作用机制尚未诠释清楚。近年来，网络药理学兴起，并被逐渐应用于中医药研究领域中。本研究采用网络药理学方法，探讨防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的作用机制，为中医药治疗慢性心力衰竭的研究提供思路和依据。

1 资料与方法

1.1 主要数据库及软件 中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、 GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.omim.org/)、UniProt(https://www.uniprot.org/)、STRING 11.0 (https://string-db.org/)、DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)、GO(http://geneontology.org/)、KEGG(https://www.kegg.jp/)、Bioconductor(https://www.bioconductor.org/)、Cytoscape 3.7.2(https://cytoscape.org/)、Perl(https://www.perl.org/)、R x64 3.6.0(https://www.r-project.org/)、Java-jre(https://www.oracle.com/java/technologies/javase-jre8-downloads.html)。

1.2 研究方法

1.2.1 防己黄芪汤有效成分的收集与筛选 分别以防己黄芪汤组方中的“防己”“黄芪”“白术”“甘草”“生姜”“大枣”6味中药名称作为关键词，通过TCMSP数据库进行检索，在“ingredients”条目下获取所有中药的活性化合物，根据药代动力学(ADME)参数，以同时满足生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18为条件，筛选出中药的有效化学成分。

1.2.2 防己黄芪汤作用靶点的收集与筛选 通过TCMSP数据库进行检索，分别以“防己”“黄芪”“白术”“甘草”“生姜”“大枣”作为关键词，在“Related Targets-Targets Infomation”条目下获取所有中药的作用靶点，利用Perl软件提取与防己黄芪汤有效成分匹配的作用靶点。将防己黄芪汤有效成分对应的作用靶点录入UniProt数据库中检索，剔除重复与不规范的作用靶点，得到防己黄芪汤有效成分作用靶点的标准化基因名称(Gene Symbol)。

1.2.3 防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭靶标基因的筛选 在GeneCards和OMIM数据库中输入关键词“chronic heart failure”进行检索，剔除重复基因，获取与慢性心力衰竭相关的靶标基因，利用Rx64 3.6.0软件运行Bioconductor程辑包，将慢性心力衰竭靶标基因与防己黄芪汤有效成分靶点基因进行映射，得出药物与疾病的交集基因，即防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的靶标基因。

1.2.4 防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的网络构建及分析

1.2.4.1 Cytoscape网络构建分析 运用Cytoscape 3.7.2软件绘制“防己黄芪汤-有效成分-慢性心力衰竭-靶点”网络，Cytoscape 3.7.2运行以Java-jre作为软件运行环境支持，再利用Cytoscape 3.7.2中的“Network analyzer”插件分析并获取网络拓扑参数，以自由度(degree)作为反映网络中节点重要性的参数，从而筛选出重要有效成分和关键靶点。

1.2.4.2 蛋白质相互作用(PPI)网络构建分析 靶标基因蛋白之间往往相互影响、相互作用，因此，将防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的靶标基因导入STRING.11.0数据库，设定物种为“Homo Sapiens”，获取基因PPI网络。运用R语言分析统计PPI网络中每个节点连接的边的数量，边的数量越多即表示该靶蛋白与其他蛋白相互作用越强。

1.2.4.3 基因本体(GO)功能富集分析和基于京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 采用Rx64 3.6.0软件运行Bioconductor的“clusterProfiler”程辑包，对防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的靶标基因进行GO和KEGG富集分析，从而注释识别基因的相关功能和信号通路。

2 结 果

2.1 防己黄芪汤的有效成分 防己黄芪汤中含有870个活性化合物，以OB≥30%和DL≥0.18为筛选条件，筛选出156个有效成分，其中，来自防己3个、黄芪20个、白术7个、甘草92个、生姜5个、大枣29个。

2.2 防己黄芪汤的作用靶点 防己黄芪汤的作用靶点共8 189个，其有效成分对应的作用靶点共1 174个，其中，来自防己19个、黄芪209个、白术11个、甘草718个、生姜32个、大枣185个。

2.3 防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭靶标基因 检索GeneCards和OMIM数据库分别得到9 861个、470个靶标基因，剔除重复基因后，获得与慢性心力衰竭相关的靶标基因共10 223个。药物与疾病靶点基因取交集，得到防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的靶标基因共113个。详见表1。

表1 防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的靶标基因

(续表)

2.4 网络构建分析结果

2.4.1 Cytoscape网络构建分析 采用Cytoscape 3.7.2构建“防己黄芪汤-有效成分-慢性心力衰竭-靶点”网络，网络中共包括238个节点和3 362条边，其中绿色节点(1个)代表慢性心力衰竭疾病，黄色节点(7个)代表防己黄芪汤及其组成药物，红色节点(117个)代表防己黄芪汤有效成分，蓝色节点(113个)代表防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的靶点，每条边表示防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的有效成分与靶点之间的相互作用关系，详见图1。网络拓扑属性分析显示，degree>10的有效成分有31个，将其作为防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的重要化合物，详见表2；degree>10的靶点有27个，分别是雌激素受体(estrogen receptor，ESR1)、过氧化物酶体增生激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG)、雄激素受体(androgen receptor，AR)、核受体辅激活蛋白2(nuclear receptor coactivator 2，NCOA2)、前列腺素内过氧化物合酶-1(prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1)、胰蛋白酶-1(trypsin-1，PRSS1)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3B)、雌激素受体β(estrogen receptor beta，ESR2)、丝氨酸/三氨酸蛋白激酶Chk1(serine/threonine-protein kinase Chk1，CHEK1)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M1(muscarinic acetylcholine receptor M1，CHRM1)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase，ACHE)、核受体辅激活蛋白1(nuclear receptor coactivator 1，NCOA1)、γ-氨基丁酸受体亚基α-1(gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-1，GABRA1)、凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ，F7)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M3(muscarinic acetylcholine receptor M3，CHRM3)、孕酮受体(progesterone receptor，PGR)、α-1A肾上腺素能受体(alpha-1A adrenergic receptor，ADRA1A)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M2(muscarinic acetylcholine receptor M2，CHRM2)、细胞凋亡调节剂Bcl-2(apoptosis regulator Bcl-2，BCL2)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3，CASP3)、转录因子p65(transcription factor p65，RELA)、半胱氨酸蛋白酶8(caspase-8，CASP8)、半胱氨酸蛋白酶9(caspase-9，CASP9)、血清对氧磷酶/芳酸酯酶1(serum paraoxonase/arylesterase 1，PON1)、蛋白激酶C阿尔法型(protein kinase C alpha type，PRKCA)、醛糖还原酶(aldose reductase，AKR1B1)、毒蕈碱乙酰胆碱受体M5(muscarinic acetylcholine receptor M5，CHRM5)，将这些靶点作为防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的关键靶点。在113个靶点中，有98个靶点与3个以上化合物连接，体现了防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭是通过多成分、多靶点之间共同作用发挥治疗机制。

图1 防己黄芪汤-有效成分-慢性心力衰竭-靶点网络图

表2 防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的31个重要化合物(degree>10)

2.4.2 PPI网络构建分析 PPI网络中共包含112个靶蛋白节点和2 156条边，边的数量排名前10位的靶蛋白节点是血清白蛋白(serum albumin，ALB)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、CASP3、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、丝裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、Myc原癌基因蛋白(Myc proto-oncogene protein，MYC)、ESR1、G1/S特异性细胞周期蛋白D1(G1/S-specific cyclin-D1，CCND1)、AR，表明这10个靶蛋白与其他蛋白的相互作用较强。详见图2。

图2 防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭PPI网络图

2.4.3 GO和KEGG富集分析

2.4.3.1 GO功能富集分析 GO分析获取137个GO条目，主要涉及DNA结合转录激活活性/RNA聚合酶Ⅱ特异性(GO：0001228，DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific)、泛素样蛋白连接酶结合(GO：0044389，ubiquitin-like protein ligase binding)、神经递质结合(GO：0042165，neurotransmitter binding)、RNA聚合酶Ⅱ基础转录因子结合(GO：0001091，RNA polymerase Ⅱ basal transcription factor binding)、核受体活性(GO：0004879，nuclear receptor activity)、转录因子活性/直接配体调节的序列特异性DNA结合(GO：0098531，transcription factor activity，direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)、类固醇激素受体结合(GO：0035258，steroid hormone receptor binding)、G蛋白偶联胺受体活性(GO：0008227，G protein-coupled amine receptor activity)等。采用R软件绘制出P<0.05的前20个GO功能富集分析气泡图，详见图3。

图3 防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭靶标基因GO功能富集分析气泡图

2.4.3.2 KEGG信号通路富集分析 KEGG分析获取121条信号通路，其中，与慢性心力衰竭相关的信号通路共35条，包括磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K-Akt)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、细胞凋亡、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等，详见表3。防己黄芪汤的有效成分可能通过作用于这些信号通路来达到治疗慢性心力衰竭的目的。采用R软件绘制出P<0.05前20条信号通路富集分析柱状图，详见图4。

表3 防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的相关信号通路

图4 防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭靶标基因KEGG信号通路富集分析柱形图

3 讨 论

近年来，运用网络药理学方法研究中药复方治疗疾病的物质基础及作用机制逐渐成为研究热点，是实现中医药现代化的途径之一。本研究基于网络药理学方法，探讨防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭的作用机制。网络药理学分析可知，防己黄芪汤中与治疗慢性心力衰竭相关的重要活性成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、芒柄花黄素、豆甾醇、毛蕊异黄酮、7-O-甲基异丙醇胺等。槲皮素是一种具有抗炎和抗氧化作用的黄酮类化合物，可通过抑制蛋白酶体活性减轻心肌细胞肥大[6]。山柰酚可显著降低脑钠素水平，并抑制心肌细胞凋亡，从而起到保护心脏的作用[7]。β-谷甾醇、豆甾醇均属于甾醇类化合物，甾醇类可抑制促炎因子表达、调控细胞凋亡途径。如β-谷甾醇可下调细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、上调Bcl-2/Bax而抑制心肌细胞凋亡，也可下调白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平从而改善炎症反应[8]。异鼠李素能通过阻断PI3K-Akt信号通路激活，从而减轻心肌肥厚，可作为心力衰竭治疗的潜在化合物[9]。这些成分与靶点、通路在心力衰竭治疗中的相互作用有待进一步探究。

与防己黄芪汤中有效成分交互作用的PPARG、CHRM1、ACHE等27个靶点，是调节肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RASS)、神经内分泌系统、炎性因子水平、心肌细胞凋亡、心室重构、心脏收缩和舒张功能、心肌缺血/再灌注等心力衰竭发病治疗的关键靶点。有研究证实，PPARG信号可影响RASS，参与调节慢性心力衰竭中的体液潴留[10]。CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM5亚型属于G蛋白偶联受体家族的毒蕈碱型乙酰胆碱受体，其表达可调控神经内分泌系统，进而影响心脏的收缩和舒张功能[11]。ACHE、GABRA1的表达可影响神经内分泌系统中的信号传导，从而调节心脏组织中的TNF-α、IL-1β、核转录因子-κB(NF-κB)等炎性因子水平[12-13]。ADRA1A表达可降低心室纤维化和心肌细胞凋亡[14]。BCL2具有抗凋亡作用，其表达与心力衰竭呈正相关[15]。CASP3、CASP8、CASP9属于半胱氨酸蛋白酶类，主要调控细胞凋亡过程[16]，CASP3可作为心力衰竭的治疗靶标，通过抑制细胞凋亡进程有助于恢复收缩功能、逆转重构甚至预防心力衰竭[17]。PON1是一种高密度脂蛋白相关的多功能酶，可保护心肌细胞免受氧化损伤[18]。PRKCA属于丝氨酸/苏氨酸激酶的蛋白激酶C家族信号因子，参与细胞增殖、凋亡、分化、迁移、心脏肥大和炎症调节，是心肌细胞中心脏收缩性和钙离子处理的基本调节剂，抑制PRKCA表达可预防心力衰竭[19-20]。AKR1B1在介导心肌缺血/再灌注损伤中起关键作用[21]。ESR1、ESR2、AR、NCOA1、NCOA2、PGR、PTGS1、PRSS1、GSK3B、CHEK1、F7、RELA等靶点参与治疗心力衰竭的作用仍需进一步探究，以期为今后研究者提供新的突破口。

防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭涉及的信号通路可能通过调控神经内分泌系统、抑制心脏重塑、抑制心肌细胞凋亡、改善心脏收缩舒张功能、影响体液炎性因子等发挥作用。在心血管疾病的治疗中，抑制心肌细胞死亡具有广泛的治疗潜力[22]。通过抑制心肌细胞凋亡，调节细胞生长，延长细胞周期，从而延缓心肌重塑的进程，进而达到治疗心力衰竭的目的。叉头状转录因子(FoxO)信号通路在调节细胞生长、细胞周期、凋亡和抗氧化应激方面发挥着重要作用[23]。PI3K-Akt信号通路被证实是控制心肌细胞存活和功能的最重要的促增殖及抗凋亡信号通路之一，在心肌细胞存活和程序性死亡的过程中发挥着关键的调控作用[24]。PI3K是一种重要的细胞信号转导分子，其在细胞外多种信号刺激激活后产生3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3作为细胞内第二信使可结合并活化其下游靶标Akt，Akt作为重要的抗凋亡调节因子，可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白如凋亡蛋白(BAD)、CASP9、NF-κB、FoXO、雷帕霉素(mTOR)等，从而介导多种生长因子调控细胞生长和存活，进而调控心肌细胞的增殖、分化、存活等过程[25-27]。活化的Akt还能够磷酸化小鼠双微体基因2(murine double minute 2，MDM2)，上调MDM2的活性，使p53功能失活或降解，阻断p53介导的促凋亡反应[28]。有研究表明，抑制PI3K-Akt信号通路可减轻压力超负荷引起的心肌肥厚及心脏结构重塑[29]。由此可见，通过调控PI3K-Akt信号通路可改善心肌细胞凋亡，延缓心肌重塑，改善心肌功能。

此外，心力衰竭的严重程度与促炎性细胞因子TNF-α、IL-6等相关，心功能越差，炎性因子水平越高，因此，抑制炎症反应是发挥治疗慢性心力衰竭作用的机制之一。TNF信号通路、NF-κB信号通路、PI3K-Akt信号通路和细胞凋亡联系密切，主要调控细胞凋亡和细胞存活以及炎症和免疫力[30]。TNF信号通路中TNF-α的下游细胞通过两个同源受体TNFR1和TNFR2发出信号，一方面作用于c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、蛋白激酶p38(p38)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)等，调控IL-1β、IL-6、白细胞介素-15(interleukin-15，IL-15)等多种炎性因子表达，驱动促炎程序；另一方面作用于CASP3、CASP8、半胱氨酸蛋白酶10(CASP10)等，影响细胞凋亡和坏死，启动组织再生[31]。Toll样受体(TLRs)信号通路能通过多种下游靶点跨膜糖蛋白TLRs激活PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路等，活化NF-κB、激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)等多种转录因子，从而介导心力衰竭时的炎症反应[32]。

环磷酸腺苷(cAMP)信号通路中的cAMP作为细胞内重要的第二信使，可作用于其下游靶点前激肽释放酶激活剂蛋白激酶A(PKA)，促使PKA活化，直接作用于cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)、BAD而介导细胞的死亡和存活，还能参与钙信号通路，调控Ca2+浓度来调节心脏的收缩舒张功能[33]。神经活性配体-受体相互作用途径，可以通过作用于神经介质质素U受体2(neuromedin U receptor 2，NMUR)、生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)、促性腺激素释放激素受体(gonadotropin-releasing hormone receptor，GNRHR)等靶点，以神经活性类固醇激素作为神经递质受体的调节剂，增强或抑制神经元活性，在缺血和灌注过程中保持线粒体功能来介导心脏保护作用[34]。

综上所述，防己黄芪汤能够通过多成分、多靶点、多通路，抑制心肌细胞凋亡、影响体液炎性因子、抑制心脏重塑、改善心脏收缩舒张功能、调控神经内分泌系统达到治疗慢性心力衰竭的目的。防己黄芪汤中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、芒柄花黄素、豆甾醇、毛蕊异黄酮、7-O-甲基异丙醇胺等有效成分，交互作用于CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM5、CASP3、CASP8、CASP9、PPARG、ACHE、GABRA1、ADRA1A、BCL2、PON1、PRKCA、AKR1B1等关键靶蛋白，从而通过DNA结合转录、神经递质结合等过程以及PI3K-Akt、MAPK等信号通路，发挥治疗慢性心力衰竭的作用。本研究仅是对防己黄芪汤治疗慢性心力衰竭作用机制的虚拟预测，还需要进行实验进一步验证。