不同骨移植材料应用于犬拔牙位点保存的实验研究

周 蓉， 束 为， 陈 武

目前种植是修复缺牙的最佳选择，而拔牙后牙槽嵴出现不可逆吸收，牙槽嵴高度和宽度不同程度减少，颊侧骨板吸收多于舌侧[1-3]，这导致拔牙后牙槽嵴形态改变，种植体很难获得理想的植入位置。为减少拔牙后骨吸收，实现种植的长期稳定与功能，临床上常使用骨移植材料进行位点保存[4-7]。目前临床用于位点保存效果较好的材料有异种骨去蛋白牛骨矿物质(deproteinized bovine bone mineral, DBBM)[8-10]，吸收速率较慢，Maiorana等[9]的研究发现在DBBM用于牙槽嵴保存后6个月，移植材料剩余颗粒占31.97%，Lindgren等[11]发现骨增量3年后DBBM剩余颗粒依然占到了24%。同种异体骨以脱钙冻干骨也称为脱钙骨基质(DBM)、冻干骨等形式在位点保存中应用，研究表明同种异体骨有良好的保存牙槽嵴形态、骨引导、骨诱导的作用[12-15]，但同种异体骨用于位点保存对后期种植的长期疗效等方面影响的研究较少。本课题组前期研究将含不同比例松质骨、皮质骨及DBM的同种异体骨1(松质骨∶皮质骨∶DBM质量比为0∶9∶1)和同种异体骨2(松质骨∶皮质骨∶DBM质量比为3∶6∶1)应用于兔拔牙位点保存，研究发现同种异体骨材料能够维持牙槽嵴形态，也能诱导新骨形成[16]。

为进一步探究几种骨材料的作用及对骨结合的影响，本实验将犬同种异体骨1、2(后文简称骨1、骨2)以及DBBM用于犬位点保存，比较3种骨粉保存牙槽嵴的效果、新骨形成情况以及位点保存位点植入种植体后的骨结合情况，希望能找到合适的骨移植材料用于位点保存，在达到减少牙槽嵴吸收的同时能有更多的新骨形成，利于后期种植体的骨结合。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

13～14个月龄健康雄性比格犬两只，体质量10～14 kg，南京市第一医院动物实验中心提供并饲养。

同种异体骨粉1、2(北京大清生物制药生物技术股份有限公司)；去蛋白牛骨矿物质骨粉Geistlich Bio-Oss®(Geistlic，瑞士)；种植体纽白特IS-Ⅱ active Ø3.5 mm×10.0 mm(Neobiotech，韩国)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型及实验分组 已通过南京医科大学伦理审查(IACUC-1901052)。拔除两只比格犬双侧下颌的第二、三、四前磨牙，共12个牙位，随机分为A、B、C、D 4组。A组，空白组，拔牙窝自然愈合；B、C、D组拔牙窝内分别填塞骨1、骨2和DBBM。

1.2.2 实验过程 比格犬称重，0.1 mL/kg陆眠宁诱导麻醉，静滴丙泊酚(0.5 mg/(kg·min))维持。双侧下颌术区局麻，分根，微创拔除，骨壁完整无破坏。按分组在牙槽窝内植入骨1、骨2、DBBM骨粉，充填至平齐颊侧牙槽嵴顶，覆盖医用胶原蛋白，空白组不植材料，水平褥式缝合。

拔牙位点保存术后3个月行种植手术，同上方法麻醉、翻瓣，测量，用内径2 mm、外径3 mm的环状取骨钻分别于第二、三、四前磨牙远中根牙槽窝中央的位置取骨，取出直径为2 mm、高8 mm的圆柱状骨，在取骨处继续制备种植窝洞，植入3.5 mm×10.0 mm种植体1枚，置封闭螺丝。种植体植入后3个月处死比格犬，分离牙龈，分离下颌骨，制取标本，进行实验观察。

1.2.3 观察指标和方法 ①大体形态学检测，以第一前磨牙和第一磨牙釉牙骨质界的连线作为参照，自制卡尺记录每个牙位近远中根牙槽窝颊侧牙槽嵴顶中央的位置，游标卡尺测量拔牙术后即刻、拔牙后3个月每个牙根对应的牙槽窝及拔牙后6个月时每个牙位近中根牙槽窝的颊侧牙槽嵴顶中央距离参照线的垂直距离，记为H0、H3、H6，比较各组之间拔牙后3、6个月时与基线相比颊侧牙槽嵴垂直高度的变化，分别用ΔH1、ΔH2表示。

因舌侧牙槽嵴相对稳定，吸收少，测量拔牙术后即刻、拔牙后3个月每个牙槽窝及拔牙后6个月每个牙位近中根牙槽窝舌侧牙槽嵴顶下方2 mm处牙槽嵴的水平宽度，记为W0、W3、W6，比较各组间拔牙后3、6个月与基线相比牙槽嵴水平宽度的变化,分别用ΔW1、ΔW2表示。所有数据的测量均由同一位术者完成。

3个月时每组样本量为6，6个月时因远中牙槽窝已行种植，仅测量比较每个牙位的近中牙槽窝的高度、宽度变化，所以每组样本量为3。

②组织学检测，将柱状骨标本置于4%甲醛固定24 h，10%EDTA脱钙，HE染色。光学显微镜下观察各组骨形成情况。选取标本中央的切片用于组织学分析。Image J软件计算各组的新生骨、剩余骨材料、结缔组织及其他组织的百分比，比较各组间的差异。

术后6个月下颌骨标本进行固定、梯度脱水，透明、包埋，制作磨片。Van-Gieson染色观察。于20倍光镜下每个种植体随机选3个螺纹近远中各6个斜面作为观测视野,采用IPP 6.0软 件 进 行 图 像 分 析 测 量 ,按以下公式计算骨-种植体结合率。 骨-种植体结合率(bone-implant contact, BIC)=骨-种植体接触长度÷种植体总长度×100%。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 位点保存的效果

颊侧牙槽嵴顶高度及牙槽嵴宽度变化：术后3个月各组的颊侧牙槽嵴高度、宽度均降低，经方差分析4组之间颊侧牙槽嵴高度的减少量ΔH1及牙槽嵴宽度的减少量ΔW1差异均有统计学意义(P<0.05)，组间两两比较A组和C组分别与其他3组相比，ΔH1、ΔW1差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 术后3个月颊侧骨高度和舌侧牙槽嵴顶下2 mm处颊舌向宽度变化Tab.1 The changes of buccal alveolar crest height and the changes of ridge width 2 mm below the ligual alveolar crest 3 months after operation mm

经方差分析，术后6个月各组的近中根处颊侧牙槽嵴高度及宽度均降低，4组之间的ΔH2、ΔW2差异均有统计学意义(P<0.05)，A组与其他3组相比ΔH2、ΔW2差异均有统计学意义，C组与D组之间高度变化的差异有统计学意义(表2)。

表2 术后6个月颊侧骨高度和舌侧牙槽嵴顶下2 mm处颊舌向宽度变化Tab.2 The changes of buccal alveolar crest height and the changes of ridge width 2 mm below the ligual alveolar crest 6 months after operation mm

2.2 组织学观察

位点保存术后3个月，各组标本都可观察到大面积矿化组织，有成熟骨小梁形成。B、C组新生骨的面积较大，高倍镜下可见成熟的哈弗系统，骨陷窝丰富。A组骨陷窝不如C组丰富，高倍镜下可见成骨细胞活跃，有未成熟的哈弗系统。比较A组还可见部分纤维结缔组织包绕新骨形成，新生骨形态排列不规律。

B、C、D组中均可见剩余材料颗粒，残留颗粒周围是含有骨细胞陷窝的矿化结构，为新生骨，D组可见少量Bio-Oss骨颗粒周围被纤维结缔组织包绕(图1)。

组织学统计分析：各组新生骨比例差异无统计学意义(P=0.072)，A组无剩余材料，与其余3组之间有差异(P=0.001)，其余3组剩余材料的比例为差异无统计学意义(P=0.083)。A组的结缔组织比例与其余3组有统计学差异，B、C、D 3组之间差异无统计学意义(表3)。

表3 各组织成分的组织学分析Tab.3 Histomorphometricanalysis of different components %

骨形态计量学分析：各组种植体周围均可见新生骨及成熟的骨小梁结构，种植体与骨紧密结合，C、D两组成熟骨小梁较A、B组多(图2)。A组的种植体骨结合率与其他3组相比差异有统计学意义，其余3组间差异无统计学意义(表4)。

表4 骨-种植体结合率Tab.4 Bone-implant contact

GP：剩余材料颗粒，NB：新生骨，CT：结缔组织，箭头：成骨细胞，星号：血管；A：空白组( ×100)；B：同种异体骨1( ×200)；C：同种异体骨2( ×200)；D：DBBM组( ×200)，剩余移植骨颗粒被结缔组织包绕图1 HE染色观察位点保存术后3个月后牙槽窝内成骨情况Fig.1 Histological observation of 3 months after extraction site preservation with hematoxylin-eosin staining

3 讨 论

种植体骨结合与植入区骨质和骨量密切相关，理想的位点保存骨材料除了能较好地维持牙槽嵴高度和宽度外，还需有良好的骨引导及骨诱导性、合适的吸收速率，有足够的新骨形成，为种植体的植入提供良好的骨质[17]，利于与种植体形成良好的骨结合。 De Risi等[18]的系统综述发现不同骨材料的吸收速率是有差异的，异种骨和人工骨的吸收速率慢，剩余材料比例最高，同种异体骨剩余材料比例最低。而剩余材料颗粒过多可能会影响新骨的形成，从而影响种植体的骨结合。DBBM具有良好的骨引导性，但是没有骨诱导性，吸收速率缓慢。同种异体骨来源广泛，有骨引导、骨诱导性。本实验中的骨1、骨2中的皮质骨和松质骨都是犬的同种异体冻干骨，有骨引导性，加入的脱钙骨基质DBM不仅有骨引导性，还有骨诱导性，有利于新骨的形成。

A：空白组；B：同种异体骨1；C：同种异体骨2；D：DBBM组图2 种植术后3个月时组织学观察(Van-Gieson染色 ×100)Fig.2 Histological observation of 3 months after implantation (Van-Gieson staining ×100)

本研究结果表明DBBM的牙槽嵴保存效果最好，皮质冻干骨和DBM混合的同种异体骨材料的位点保存效果与DBBM相似，含30%松质骨的同种异体骨也有较好的牙槽嵴轮廓保存效果，较DBBM稍差，这与本课题组前期研究结果一致[16]。C组材料骨2是30%松质骨、60%皮质骨和10%DBM的混合物，3个月时C组的牙槽嵴高度、宽度减少量大于B组，差异有统计学意义，这可能与松质骨吸收速率较快有关，Eskow等[19]分别将100%同种异体冻干皮质骨和100%同种异体冻干松质骨用于位点保存，约18周后，发现松质骨组牙槽嵴高度降低更多。而6个月时B组与C组的颊侧牙槽嵴骨高度以及宽度变化均无统计学差异，这可能是因为骨2中也含有60%的皮质骨，后期吸收速率趋于稳定，且新骨不断形成改建。

本研究观察到在位点保存术后3个月，不论是自然愈合还是拔牙窝内充填骨材料，牙槽窝都有较多新生骨组织、成熟骨小梁形成。在其他犬的实验研究中也发现，骨缺损区植入骨移植材料后3个月已经形成成熟的板层骨结构[20]。C组即骨2组的新生骨比例最大，自然愈合组最小，新生骨比例为C>B>D>A，无统计学差异，但这也在一定程度上反映了3种骨移植材料均可以促进新骨形成。Froum等[21]的研究发现自然愈合组和同种异体脱钙冻干骨(DFDBA)组的新生骨比例分别为32.4%、34.7%，差异无统计学意义。Demetter等[22]比较了不同比例皮质骨、松质骨混合的同种异体冻干骨(FDBA)，用于人磨牙位点保存后新生骨的比例，各组间也无统计学差异。

Lindgren等[11]发现骨增量3年后DBBM剩余颗粒依然占到了24.0%±13.5%，DBBM的低替代率可能会影响牙槽窝内骨的重建进而导致拔牙窝内的新骨形成减少，影响后期种植体的骨结合。但是也有实验研究发现DBBM应用于位点保存及上颌窦提升术中不影响种植体的骨结合[23-24]。Piattelli等[25]的研究发现DBBM用于上颌窦提升后6个月移植物颗粒大部分被成熟的致密骨包围，与新骨之间不存在间隙，有良好的骨整合。本实验3种移植材料剩余颗粒的比例无统计学差异，种植术后3个月的组织学结果也表明，移植骨材料的3组与空白组相比种植体的结合率都更高，组间无差异，说明3种骨移植材料均不会对后期种植体的骨结合产生不利影响，而是提高了种植体骨结合率。

综上所述，拔牙后进行位点保存既有助于保存牙槽嵴形态，对后期种植体骨结合也有积极作用。但本实验样本量较小，还需进一步研究证实。