谷物β-葡聚糖测定方法研究进展

李丹青，张凯龙，闫金婷，胡新中，董 锐，闫喜梅

(1.商洛学院，陕西商洛 726000;2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710119；3.西安市农产品质量安全检验监测中心，陕西西安 710077)

β-葡聚糖是由β-葡萄糖苷键连接D-葡萄糖而成的非淀粉多糖，在自然界中广泛存在。其按结构可分为β-1,3-葡聚糖、β-1,3-1,6-葡聚糖和β-1,3-1,4-葡聚糖，主要来源有谷物、细菌和真菌[1]。

在众多来源中，谷物β-葡聚糖由于其丰富、安全、可靠的来源以及优良的理化特性成为研究焦点。谷物β-葡聚糖具有多种生理功能和作用。它可以调节血糖水平，预防二型糖尿病[2-4]；降低血清胆固醇水平，预防心血管疾病[5-6]；平衡肠道菌群，预防结肠癌[7-9]；调节血压[10]和增强免疫细胞活性[11]。此外，谷物β-葡聚糖还可作为添加剂应用于乳制品、冰淇淋等食品生产，改善这些产品的感官品质[12-13]。

当前，谷物β-葡聚糖的检测方法主要依靠酶法[14]。此外，研究人员基于β-葡聚糖的特性还开发了荧光法[15]、粘度法[16]等方法。不同的检测方法在成本、检测结果准确度和检测效率等方面存在差异，因此适用于不同的谷物产品或检测需求。

作为一种重要的膳食纤维，β-葡聚糖的检测在谷物尤其是大麦和燕麦的育种、加工和产品开发等方面都被十分重视[17-18]。开发经济、快速、准确、可大批量检测的方法已成为燕麦和大麦产业亟需解决的问题。本文综述了当前谷物β-葡聚糖的检测原理、相关方法和标准，以期为准确检测谷物β-葡聚糖含量、开发特定检测需求的方法等提供参考。

1 谷物β-葡萄糖的结构

谷物β-葡聚糖来源广、含量高、分子量大，是一种优良的水溶性膳食纤维[19]。作为一种植物细胞壁成分，β-葡聚糖可以与荧光染料结合显色，因此采用荧光染色技术可以观察到它在谷物籽粒中的分布[20-22]。

燕麦和大麦是最常见的谷物β-葡聚糖来源，小麦和黑麦中含有一定的β-葡聚糖[23]。与细菌和真菌β-葡聚糖不同，谷物β-葡聚糖由β-1,3键和β-1,4键混合连接而成，是一种线性多糖。其中，β-1,4键连接D-葡萄糖单体形成纤维糖单元，而β-1,3键再将这些纤维糖单元连接形成β-葡聚糖。β-1,3键的存在可以有效避免分子紧密堆积并且使其具有一定的水溶性，因此β-1,3与β-1,4键的比例、纤维三糖和纤维四糖的比例等因素会对β-葡聚糖的理化特性造成影响[23-24]。

在不同的基因型和环境下，β-葡聚糖在谷物中的含量和结构会有所差异(表1)。大麦和燕麦中β-葡聚糖的含量较高，分别占籽粒干重的 2.2%～8.8%和1.73%～5.70%；而小麦和黑麦中β-葡聚糖含量分别为0.38%～0.64%和 1.4%～2.6%[25-26]。此外，谷物β-葡聚糖分子内纤维三糖和纤维四糖的比例、β-1,3键与β-1,4键的比例、分子量等会存在一定的差异。例如，燕麦β-葡聚糖的分子量较高，为180～850 kDa[27]，而黑麦β-葡聚糖分子量仅为21 kDa[28]。这些差异主要归因于谷物不同的基因型和生长环境。β-葡聚糖在结构上的差异会使其具有不同的理化特性，如β-1,3与β-1,4键的比例与水溶性有关，而β-葡聚糖的分子量与其溶液粘度有关。谷物β-葡聚糖溶液具有很高的粘度，是一种非牛顿流体，β-葡聚糖浓度、分子量越大，其溶液粘度越高[29]。β-葡聚糖还可以形成凝胶，目前控制其凝胶行为的因素尚不清楚，但一般认为凝胶速率与β-葡聚糖的分子量有关。除此以外，β-葡聚糖还可以吸水溶胀，β-葡聚糖上的羟基可以与水分子通过氢键作用结合，同时其分子内的纤维三糖或纤维四糖可以被β-1,3键连接形成结合区，从而有效地将水束缚其中[30]。

表1 谷物β-葡聚糖化学结构特性Table 1 Chemical structure properties of cereal β-glucan

2 谷物β-葡聚糖的检测原理

目前谷物中β-葡聚糖含量有多种检测方法，根据β-葡聚糖的性质，这些方法的原理可以概括为四种:将β-葡聚糖水解为葡萄糖单体；将β-葡聚糖与某种染料特异性结合；利用β-葡聚糖自身的物理特性；其他。

2.1 水解为葡萄糖单体

如前所述，燕麦β-葡聚糖是由β-1,3键和β-1,4键连接D-葡萄糖而成的线性多糖，直接定量β-葡聚糖并不容易，而将β-葡聚糖水解为D-葡萄糖单体，通过检测葡萄糖单体的含量来定量β-葡聚糖就比较可行。通常可采用生物水解法和化学水解法来水解β-葡聚糖。生物水解法需要选择特定的专一性水解酶切断β-1,3键和β-1,4键，使β-葡聚糖降解为葡萄糖单体[14]；而化学法是采用一定浓度的酸溶液在特定温度下将β-葡聚糖裂解为葡萄糖单体[33-34]。葡萄糖单体可以利用氧化酶法将其转化为有色物质，在波长510 nm下该物质吸光度与葡萄糖含量成正比。此外，采用高效液相色谱(HPLC)技术也可以检测葡萄糖单体的含量。最后可通过葡萄糖含量定量得出β-葡聚糖的含量。

2.2 与染料结合

β-葡聚糖可以与特定物质结合，结合物颜色或荧光强度会发生变化。这是谷物β-葡聚糖定量检测的另一主要原理。如β-葡聚糖能与染料刚果红结合，其结合机制可能是由于疏水作用，结合物溶液的吸光度发生改变。通过检测波长550 nm处的吸光度变化可以得出β-葡聚糖的含量[35]。此外，β-葡聚糖还能和荧光增白剂Calcofluor结合，通过检测结合物荧光强度的变化也可以定量检测β-葡聚糖的含量[36]，其具体结合机制目前尚不明确。

2.3 β-葡聚糖自身物理特性

β-葡聚糖可以增加溶液粘度，同时还具有很强的吸水性，利用这些物理特性可以检测谷物中β-葡聚糖含量。对于同一种特定分子量的β-葡聚糖，其溶液粘度与浓度成正比，因此通过检测溶液粘度可以检测β-葡聚糖含量[16]。值得注意的是，β-葡聚糖的分子量也会影响溶液粘度，分子量越高，粘度越大，因此使用该原理检测时还需注意分子量的影响。β-葡聚糖的强吸水性可以增大谷物体系的持水性，即β-葡聚糖含量越高，体系的持水量越大。根据这一原理，Niu等[37]利用溶剂保持能力开发了燕麦β-葡聚糖检测的新方法。

2.4 其 他

除了上述原理外，β-葡聚糖检测的原理还有光谱法、酶联免疫吸附法等。光谱法是利用近红外光谱技术，β-葡聚糖中的某些化学键在近红外光谱下会产生伸缩振动倍频吸收，符合朗伯比尔定律，即吸收峰的强度和待测物的浓度成正比[38]。而酶联免疫吸附法的原理是开发特异性单克隆抗体，将β-葡聚糖作为底物与其特异性结合，通过显色反应定量检测β-葡聚糖含量[39]。

3 谷物β-葡聚糖的检测方法与相关标准

β-葡聚糖在食品等领域应用广泛，并且具有重要的生理活性，在燕麦产业各个环节(育种、加工、产品开发等)都需要检测β-葡聚糖含量。表2总结了目前各β-葡聚糖检测方法原理、优缺点以及相关标准。

3.1 酶 法

目前，酶法是β-葡聚糖最常用的检测方法，已被开发成试剂盒成为经典的商用检测方法。该方法于1985年被McCleary[14]首次提出并改进，可用于检测谷物及其制品中β-葡聚糖的含量。酶法是国际公认的β-葡聚糖检测方法，已经被美国分析化学家协会(AOAC International,995.16)[40]、美国谷物化学家协会(AACC,32-23.01)[41]等多个国际权威组织认证。该方法采用地衣聚糖酶和β-葡萄糖苷酶水解(图1)，首先在沸水中使谷物或其制品的β-葡聚糖溶出，进而被地衣聚糖酶(lichenase)特异性水解为小分子寡糖，之后采用β-葡萄糖苷酶将其裂解为单个的葡萄糖分子，通过检测葡萄糖的含量可以定量检测β-葡聚糖，即使用葡萄糖过氧化酶缓冲液将葡萄糖转换为有色物质，在波长510 nm处定量检测其含量。该法检测特异性强，不易被其他多糖干扰，检测结果准确度高、稳定，是使用最广泛的β-葡聚糖检测方法，但高纯度专一性强的地衣聚糖酶和葡萄糖苷酶价格昂贵，检测成本较高。

图1 谷物β-葡聚糖酶法检测原理Fig.1 Principle of enzymatic quantitative analysis of cereal β-glucan

为了减少样本用量、节省试剂消耗量、节约检测成本，Hu和Burton[42]对这一检测方法进行了一定改进。他们采用96孔板法检测了21个不同燕麦样品的β-葡聚糖含量，将传统的酶法检测使用的地衣聚糖酶和β-葡萄糖苷酶用量减少了25%，每个样品检测成本减少了22%，劳动力成本减少了25%。之后。Motilva等[43]使用微量法在Megazyme酶法检测的基础上进一步优化，检测了β-葡聚糖含量从0.27%到75%的样品。传统的Megazyme酶法在样品被地衣聚糖酶水解后，需要加入0.1 mL β-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖单体，并用3 mL GOPOD(葡萄糖过氧化酶缓冲液)试剂反应显色。而改进后的微量法只需要20 μL的β-葡萄糖苷酶和210 μL的GOPOD，经t检验，其检测结果与酶法无显著差异。

3.2 色谱法

采用色谱技术可以检测谷物β-葡聚糖含量，这是因为多糖在一定温度的酸性条件下可以被降解为小分子物质。酸溶液的浓度、温度和水解时间等会影响水解效率，导致水解不彻底或破坏产物单糖的结构。水解产物葡萄糖可通过气相色谱(GC)或高效液相色谱法(HPLC)进一步分析。Johansson等[33]比较了三种酸溶液(HCl、TFA和H2SO)在不同酸浓度、温度和水解时间下对β-葡聚糖的水解情况，结果发现，在最弱的酸性条件下(37 ℃,pH=1,模拟人胃液酸性条件)，β-葡聚糖不会被水解；而三种酸溶液在120 ℃、持续1 h水解β-葡聚糖时得到了相同的葡萄糖含量。该方法检测结果与酶法接近，准确度高，但需使用价格昂贵的色谱设备，并且前处理过程的实验条件(高温、强酸)具有较高的安全风险，这些因素在一定程度上限制了该方法的使用。

3.3 刚果红法

刚果红染料可以与β-葡聚糖结合形成复合物。刚果红自身是一种红色染料，在紫外可见光谱区具有吸光度。加入β-葡聚糖后，结合物在波长550 nm处的吸光度会随着β-葡聚糖浓度的增加而改变。使用该方法检测谷物β-葡聚糖含量时，需在一定浓度的刚果红溶液中加入不同含量的标准β-葡聚糖，混合后建立β-葡聚糖浓度标准曲线，进而可测得样品中β-葡聚糖含量[35]。该法中使用的刚果红染料价格相对便宜，成本较低。但刚果红与β-葡聚糖的结合并非特异性，当其应用于谷物中时，易被其中的其他水溶性多糖如戊聚糖等造成干扰，影响测量结果，因此该法在准确度上有一定限制。

3.4 荧光法

荧光法也是常用的β-葡聚糖定量方法之一。这种方法是基于溶液荧光强度的改变实现的，即荧光剂Calcofluor和β-葡聚糖能特异性结合形成复合物，体系溶液的荧光强度与β-葡聚糖浓度有关。基于此原理，Jorgensen[44]在1988年设计了一种自动流动注射分析系统，利用湿法分析化学技术将样品溶液与荧光剂混合，来检测样品中β-葡聚糖的含量。该方法已广泛应用于啤酒、麦芽汁等液体样品中β-葡聚糖的检测。该法需将含β-葡聚糖的样品稀释成溶液，采用标准β-葡聚糖溶液建立浓度-荧光强度标准曲线，进而可得到样品中β-葡聚糖含量。与传统的酶法相比，荧光法检测成本较低，同时其检测结果与酶法呈显著相关，准确度较高。但是，荧光剂Calcofluor稳定性较差，易光分解，而且谷物体系成分复杂，其中的蛋白质和淀粉等物质也会对结果产生干扰。这些因素在一定程度上限制了它在谷物β-葡聚糖测定中的应用。

3.5 粘度法

β-葡聚糖具有高粘度，溶液浓度越大，粘度越高。对于燕麦粉和大麦粉来说，其浆液的表观粘度主要取决于β-葡聚糖的含量，而淀粉和蛋白质只有很小的影响。Colleoni-Sirghie等[16]将燕麦粉分别加入到去离子水、硝酸银溶液(抑制内源性β-葡聚糖酶)和碱溶液(溶解水溶性和水不溶性β-葡聚糖)，制得燕麦粉匀浆，研究匀浆液表观粘度与β-葡聚糖含量的关系，并采用偏最小二乘法(PLS)预测了β-葡聚糖含量，结果显示，利用硝酸银溶液燕麦粉匀浆的表观粘度可以很好地预测β-葡聚糖含量，其结果与酶法结果非常接近。粘度法测定原理简单、成本低、操作简便，然而β-葡聚糖溶液粘度还受分子量的影响，采用该法时需要使用分子量接近的样品。因此，该方法可用于检测同种分子量β-葡聚糖的含量，例如同种燕麦籽粒制得的不同产品中的β-葡聚糖含量。

3.6 溶剂保持能力法

溶剂保持能力(SRC)是指小麦粉在一定离心力作用下保持溶剂多少的能力，可以用来衡量小麦粉及其制品的品质特性。其原理是小麦粉中聚合物分子如蛋白质、淀粉、戊聚糖等在不同溶剂中可以产生不同程度的溶胀。SRC检测可选用水、5%(w/w)乳酸水溶液、5%(w/w)碳酸钠水溶液和50%(w/w)的蔗糖水溶液四种溶剂。这四种溶剂分别对应小麦粉中不同聚合物组分，其中水SRC体现了面粉中所有聚合物组分的溶胀能力；乳酸SRC具有面团发酵过程中相似的pH值，因此与谷蛋白的溶胀能力有关；碳酸钠SRC溶液的pH值较高，能使淀粉羟基解离，破损淀粉在此溶液中能够吸水膨胀，因此该SRC与破损淀粉含量有关；蔗糖SRC溶液浓度高，并且呈中性，该溶液放大了阿拉伯木聚糖网络的溶胀效果，因此与小麦戊聚糖含量有关[45]。β-葡聚糖是一种大分子聚合物，含有较多的羟基，吸水性强，β-1，3键连接的纤维糖单元能束缚水分子，因此具有很强的吸水溶胀能力。Niu等[37]首次将小麦SRC方法应用于燕麦，研究了不同溶剂与燕麦溶胀特性之间的关系，从中筛选出能反映燕麦β-葡聚糖含量的氯化钙溶剂。该方法检测β-葡聚糖含量时，可直接将对应溶剂(25 g)加入至5 g燕麦粉中，离心后通过检测燕麦粉保持溶剂的重量预测β-葡聚糖含量，原理简单，操作简便。但是谷物体系中的其他大分子聚合物也会产生溶胀，当β-葡聚糖含量较低时不易被检出，因此该方法的检测准确度有待进一步优化。使用该方法可以预测燕麦β-葡聚糖含量的大致区间，因此可用于育种等环节β-葡聚糖含量的初步筛选。此外，我们先前的研究结果还表明，燕麦粉SRC与β-葡聚糖的分子量也有显著相关性[46]，这也为β-葡聚糖分子量的快速检测提供了一些思路。

3.7 近红外法

近红外光谱已被广泛用于农业、制药、高分子制造和食品品质检测中。在近红外光谱区，分子中化学键(如C-H、N-H、O-H键)在特定波长具有特征峰，通过分析某物质的光谱区单一或多种分子的倍频峰可以检测其组成成分。使用近红外方法预测某种组分含量时，需首先采集样本集的近红外光谱并对原始光谱进行预处理，之后采用数学分析建立该组分的预测模型，最后对该模型检验并转换应用[47]。目前，国内外已有一些研究报道了采用近红外方法对谷物β-葡聚糖的检测，这些研究使用的样品主要是粉碎后的谷物粉。部分研究使用完整的谷物籽粒进行检测，并且这些研究均以Megazyme酶法检测结果作为参比值进行数学建模[48-54]。Schmidt等[38]评估了近红外光谱法测定大麦中β-葡聚糖的方法的潜力，他们使用四种不同的近红外仪器分析了107种大麦样品(分别采用全籽粒和大麦粉)，首先对光谱进行采集并对原始光谱进行预处理，采用偏最小二乘法(PLS)建立了大麦β-葡聚糖近红外预测模型，结果表明，所有测试显示出了对β-葡聚糖监测有一定的适用性(R2>0.78)。该方法快速简便，可以短时间内检测大批量样品。需要注意的是，近红外方法检测结果的准确性受多种因素影响，包括样本化学参比值的准确性、待测指标在样本中的含量以及是否呈正态分布、高强度背景和谱峰重叠、样本规模、选用的数学模型等。β-葡聚糖结构单一，其分子内化学键很容易与燕麦中其他组分(淀粉、蛋白质等)发生重叠，影响准确性。该方法适用于样本量较大时的检测，然而在建立该方法时仍需大量已知化学参比值的样本(样本量一般需大于100)建立近红外定量模型。

3.8 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法(ELISA)是一种常用的生化分析测定法。该方法使用特定抗体检测液体样品中配体的存在。ELISA也可应用于谷物β-葡聚糖含量微量水平的测定。Rampitsch等[39]开发了不同的单克隆抗体，研究了他们与来自燕麦和大麦β-葡聚糖的反应程度和特异性，使用ELISA对市售燕麦β-葡聚糖检测，其结果在一定范围内呈线性(1～20 ng β-葡聚糖·mL-1)。此外他们优化了ELISA实验条件，并开发了一种能够节约时间和劳动成本的样品大批量检测方法。理论上ELISA方法可以检测纳克水平上的β-葡聚糖，可以应用于样本量较少时的微量测试。然而由于该方法特异性极强、灵敏度高，可能不能识别具有相似结构的所有β-葡聚糖，其适用性有待进一步研究。

4 结 论

谷物β-葡聚糖是一种重要的膳食纤维来源，在谷物尤其是燕麦和大麦的育种、加工等多个环节中都需要检测β-葡聚糖的含量。在目前所开发出的谷物β-葡聚糖检测方法中，酶法、色谱法、荧光法可用于准确定量β-葡聚糖含量。粘度法和溶剂保持能力法操作简便，可用于β-葡聚糖含量初步筛选。近红外方法检测快速，可用于样本量较多时的批量检测。人们可综合考虑准确度、操作效率、成本等因素合理选用符合自身需要的检测方法。