MicroRNA作为P13K/AKT/mTOR信号网络的调节剂参与结肠癌转移发病机制的研究进展

薛静，周军,魏海梁，闫曙光，惠毅

结肠癌是最常见的癌症之一，也是全球癌症死亡的主要原因，具有发病率高、易发生转移等特点。近年来其发病率和死亡率呈逐年上升趋势[1]，大约35%结肠癌患者在出现疾病症状时被诊断为Ⅳ期转移性疾病，而治愈性手术5年内约40%的患者可能出现复发或转移，转移是其预后不良及死亡的主要原因[2-3]，因癌细胞的转移是一个复杂且多步骤的过程，如果能够将其治疗阵线前移，及早干预，就有可能阻止或延缓其恶变为癌或癌转移。因此，在临床诊断和治疗中探索其细胞或分子微环境水平上侵袭、增殖、转移和肿瘤生物学行为机制，抑制转移过程极为重要[4]。MiRNA是一类内源性表达的非编码RNA，通过与靶基因相互作用共同调节基因表达，从而在肿瘤细胞生物学进程中发挥重要作用[5]；大量MiRNA通常位于与癌症相关的不稳定区域或基因组区域，其异常表达已被广泛认为在结肠癌发生及转移这一致病过程中起抑癌或促癌的关键调控作用[6]。有研究显示，转移过程是由控制细胞迁移、粘附和增殖的复杂分子网络调节的，结肠癌的恶化、转移与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关；又有研究发现MiRNA可以调节与结肠癌转移过程相关的信号通路，从而影响结肠癌的发生和转移。本文就 MiRNA靶向信号网络PI3K/AKT/mTOR干预结肠癌转移发病机制研究新进展进行综述。

1 结肠癌转移与EMT及TUSC3

1.1 EMT是涉及结肠癌侵袭和转移的关键机制

肿瘤转移涉及癌细胞与周围组织间的相互作用，是多基因参与、多机制调控的复杂过程，也是结肠癌治疗中临床肿瘤学主要问题，包括多个阶段：正常组织-癌前病变-原位癌-原位肿瘤细胞异常增殖-肿瘤细胞从原发部位脱落-侵袭性癌(即发生转移)，整个过程的前提是肿瘤的侵袭及运动能力的增强，始动环节为肿瘤细胞脱离原发部位，在肿瘤细胞脱离原发部位之前，癌细胞必须通过改变细胞粘附力来打破组织结构[7]，这其中可逆的EMT转变过程起着关键作用[8]。

EMT是多种组织和器官分化、修复不可或缺的发展过程，指上皮细胞在细胞形态学与生物学上向间质细胞转化，从而具备间质细胞游走迁移和浸润能力。其2个标志性因子是上皮型钙黏蛋白(E-cadherin) 和波蛋白(Vimentin)， E-cadherin的破坏或表达减低是促进实体瘤细胞迁移和侵袭的首要因素[9]。在促进肿瘤细胞发生及转移的EMT过程中，E-cadherin作为上皮细胞标志蛋白被抑制，而间质细胞的标志物Vimentin处于激活状态[10]，此时，癌细胞失去上皮特征并获得间充质表型，转化的细胞进一步显示出增强的运动性、基质重塑活性和侵袭性，从而使得肿瘤细胞运动能力增强，可以离开原位组织，为肿瘤转移和发生提供了可能性。研究证实[11]，不适当的激活EMT可以通过多种机制促进肿瘤的发生及转移，EMT已被发现是癌症转移的关键机制，是癌细胞扩散和转移的驱动力，并与癌症复发有关。且越来越多证据表明[12]，EMT作为涉及结肠癌侵袭和转移的关键早期事件，可通过使结肠肿瘤细胞运动、迁徙能力增强导致癌细胞从原发性肿瘤脱离并通过基底膜侵入循环系统，循环肿瘤细胞经过其逆过程间质上皮转换(MET)来继续形成转移灶进而使癌细胞发生远处转移。此外，EMT的发生需要具备两个条件：①细胞本身能够发生EMT；②允许EMT发生的微环境。癌症被认为是微环境的产物，而结肠癌肿瘤微环境的存在为EMT的发生提供了前提，促进了结肠癌的发生及转移。这与癌细胞转移 “种子-土壤” 学说，认为癌细胞(种子)必须在靶器官 (土壤)中找到合适的微环境才能发生转移这一观点也是一致的。

1.2 TUSC3基因是结肠癌发生及转移的关键基因

TUSC3基因，主要位于细胞内质网中，在催化蛋白质N-糖基化的过程中起着非常重要的作用，而N-糖基化与肿瘤的侵袭和转移密切相关，TUSC3通过这一过程参与了肿瘤发生及转移机制。当前，越来越多研究报告称TUSC3在各种癌症的多步过程中作用显著，尤其在结肠癌中，其功能研究主要集中在增殖、侵袭及转移三个方面[13]。TUSC3作为结肠癌的癌症启动子处于高表达状态，上调的TUSC3表达与结肠癌的T分期、淋巴转移、远处转移显著相关[14]。此外，TUSC3也是结肠癌转移的关键靶基因，通过促进结肠癌细胞的生长和扩散，增强了癌细胞的转移能力。研究表明[15]，TUSC3过表达可通过两个途径促进EMT进程，进而使结肠肿瘤细胞侵袭和转移能力增强：(1)激活PI3K/AKT、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)以及Wnt蛋白/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)通路，促进结肠癌细胞的EMT；(2)TUSC3过表达导致Vimentin蛋白的上调和 E-cadherin的下调；即在结肠癌中TUSC3过表达诱导癌细胞发生EMT相关转变。EMT作为结肠癌侵袭和转移的关键机制，也是转化生长因子-β(TGF-β)介导的关键途径，可抑制肠上皮细胞中的鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)激活并抑制TGF-β信号传导，从而促进结肠癌的转移[16]。同样的研究，在TUSC3沉默的细胞中，免疫抑制细胞因子TGF-β1被上调[14]。因此，TUSC3过表达也可激活与KRAS相关的信号通路来诱导EMT，通过KRAS突变维持结肠癌的转移，证实了TUSC3作为结肠癌转移的关键基因通过影响EMT，PIK3/AKT、MAPK、Wnt/β-catenin、KRAS和TGF-β等信号通路，在结肠癌的发生及转移中起一定作用，为结肠癌的基因治疗提供了新靶点。

2 MiRNA在结肠癌转移过程中的作用

MiRNA是小的非编码RNA分子的保守家族，可作为基因表达的关键调节因子和蛋白质翻译的负调节因子，影响信使核糖核酸(mRNA)的稳定性，并调节许多信号通路和细胞过程以参与细胞间通讯。通过与mRNA3′-非翻译区(3′-UTR)结合共同调节基因表达，从而抑制蛋白翻译或mRNA降解。这些MiRNA中约有50%位于癌症易碎基因组区域，这表明MiRNA与癌症的发病机制、进展、诊断和预后关系密切。新兴数据表明，异常MiRNA表达作为癌症标志物，取决于目标基因的多种功能，一个MiRNA可调节多个靶基因，相反单个靶基因也可受多个MiRNA的调节，因此MiRNA与靶基因之间形成复杂的调节网络，这种独特之处使得MiRNA 能通过信号调节对多种细胞分化过程产生协同作用[17]。

MiRNA广泛参与肿瘤侵袭及转移过程，其机制包括四个方面[18]：调节肿瘤细胞EMT、调控肿瘤细胞生长微环境、癌基因及抑癌基因的表达、调节肿瘤转移相关基因表达及对血管生成的调控。近几年，MiRNA在肿瘤的起始、进展、血管生成、转移和化学抗性中的功能也受到越来越多的关注[19]。特别地，MiRNA谱的改变已经与包括结肠癌在内的各种癌症的转化和转移相关。结肠癌转移是一个复杂且非随机的多阶段过程，包括增殖、运动、粘附、侵袭、生长、归巢、免疫逃逸和新血管形成几个阶段；入侵最终导致癌细胞通过循环系统或淋巴系统侵入并进行流体运输，并渗入到远处的组织中，在这些组织中它们最终定居并发展成肿瘤[20]。研究发现[19]，原发性结肠癌和转移性结肠癌均伴有血流，MiRNA则发挥着促血管生成或抗血管生成作用，且许多MiRNA在调节T、B淋巴细胞活化、固有和适应性免疫反应以及结肠癌细胞的浸润中尤为关键。MiRNA通过帮助结肠癌的癌细胞逃避血液/淋巴管中免疫系统的识别，从而使癌细胞从毛细血管逸出并侵入远处器官，一旦血管生成开始，癌细胞就会快速生长，这也是结肠癌发生转移之前的关键一步。在这种情况下，有研究发现，越来越多的MiRNA可以调节与结肠癌转移过程相关的信号通路进而发挥MiRNA癌基因或抑癌基因功能，这些通路包括磷酸酶和肌腱蛋白同源物(PTEN)/PI3K等。另有研究证实[21],MiRNA可作为调控EMT的重要抑制剂或启动子在结肠癌转移中起作用。

基于此，探讨不同MiRNA因子作为结肠癌转移信号网络的调节剂对防治结肠癌发生及转移尤为重要。

3 PI3K/AKT/mTOR信号网络

随着人们对肿瘤分子机制认识的深入研究，许多促肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和抑制凋亡的分子已成为肿瘤治疗的新靶点。PI3K/AKT/mTOR通路被认为是结肠癌发生及转移最重要的信号网络之一，具有抑制细胞凋亡、促进肿瘤血管生成、促进其侵袭及转移等功能，PI3K/AKT/mTOR共同组成信号转导通路的上下游，其关键分子包括：PI3K、AKT、PTEN和mTOR等[22]。

PI3K是一种脂质激酶，包含两个亚基：催化(p110)和调节(p85)，普遍存在于胞浆中，静息状态下无活性，是细胞内信号通路的始动因子。当细胞受生长因子等刺激后，PI3K被激活并聚集到细胞膜上，并将其底物磷酸肌醇4,5二磷酸(PIP2)磷酸化成为磷酸肌醇三磷酸(PIP3)。AKT是一种丝氨酸蛋白激酶，作为一些基本细胞功能的中央调节剂，参与肿瘤的发生及转移，也是PI3K/AKT/mTOR信号网络的重要组成部分，PI3K的过表达标志着PI3K/AKT通路激活，活化的AKT转位到胞浆中或胞核内，磷酸化核因子-kB(NF-kB)、凋亡相关蛋白caspase-9、Bcl-2、cyclin、细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)和mTOR等一系类底物，从而调控细胞的生长、增殖、迁移并介导血管生成的调节，其家族成员包括能够促进细胞增殖和存活的磷酸化AKT(p-AKT)。Osada等[23]研究发现在晚期结肠癌的转移灶中p-AKT呈较高的阳性表达率，充分说明了AKT与结肠癌转移密切相关。mTOR是由PI3K调节的非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，已在几种人类恶性肿瘤中发现了激活的 mTOR通路[24]，活化的mTOR参与细胞的生长、增殖、分化，起着中心调控作用，因此，可作为抗癌治疗的诱人靶标。此外，mTOR是与AKT相互作用的信号转导通路之一。有研究显示[1]，在PI3K/AKT/mTOR 信号网络中，PI3K 通过催化生成 PIP3，激活下游信号分子AKT，进而激活其下游 mTOR，PI3K/AKT /mTOR三者组成信号网络的上下游参与结肠癌细胞的增殖、侵袭和转移。

PTEN被定义为一种抑癌基因，也被称为p53之后第二个最频繁突变的基因，其表达主要受MiRNA、乙酰化、磷酸化及泛素化等转录后调控[25]，功能是抑制PI3K介导的信号转导，若其表达缺失则可使PI3K过表达，导致PI3K/AKT /mTOR通路激活。有研究发现，未发生转移的结肠癌病例中约37%存在PTEN蛋白缺失，转移性结肠癌中PTEN蛋白缺失率约75%，PTEN表达与肿瘤分化程度、有无脉管浸润及远处转移有关[26]，而癌细胞转移到远处通常取决于细胞增殖、存活和迁移的内在能力[27]。此外，PTEN编码作为一种双特异性蛋白磷酸酶，可通过去磷酸化将磷脂酰肌醇-3,4,5-PIP3转化为磷脂酰肌醇-(3,4)-PIP2，表明PTEN发挥负调控蛋白激酶的作用信号级联反应，通过抑制磷酸化AKT激活而成为PI3K/AKT/mTOR信号网络的主要负调节剂[28]。同理，研究发现[29]，PI3K/AKT/mTOR 信号网络作为蛋白质合成的主要信号调节通路，与结肠癌细胞的增殖、侵袭、凋亡及细胞周期关系密切。另外，PTEN可抑制血管内皮生长因子介导的血管生成，而靶向抑制PTEN表达，可激活 PI3K/AKT/mTOR信号转导通路，加速血管生成，为结肠癌的转移提供条件。

基于肿瘤侵袭及运动能力的增强是转移的前提，又有研究指出[30]P13K/AKT/mTOR信号网络通过使下游分子70-KDaS6激酶(p70s6k)磷酸化活化，一方面可以促进肌动蛋白细丝重构，使细胞运动能力显著增强；另一方面，活化的AKT还可增加NF-KB转录活性，使肿瘤细胞运动功能增强，有助于癌细胞侵袭，与结肠癌转移密切相关。因此，寻找PI3K/AKT/mTOR信号网络的调节剂对于防治结肠癌转移至关重要。

4 MiRNA靶向P13K/AKT/mTOR信号网络与结肠癌转移发病机制相关研究

在结肠癌发生及转移过程中，MiRNAs发挥着不同作用，不同的MiRNA可能增高或降低，研究预测[31]，人类存在1000多种MiRNA，调控约1/3的基因表达，其异常表达直接参与各种疾病的发生及发展。已经证明了几种特定MiRNA通过调节P13K/AKT/mTOR信号通路中的基因表达发挥促癌或抑癌作用参与结肠癌的发生及转移。同时EMT过程也被认为与结肠癌癌细胞的迁移、增殖、侵袭密切相关。

4.1 MiRNA可以促进结肠癌细胞发生及转移

(1)miR-93：张剑涛等[32]发现，在结肠癌组织及结肠癌细胞系中miR-93存在显著的高表达，其异常升高和结肠癌的侵袭和转移相关，通过生物信息学方法结合双荧光素酶方法证实了PTEN为miR-93调控的靶蛋白，此时PTEN 的表达受到 miR-93的抑制。此外，miR-93水平升高使PI3K/AKT信号转导通路表达增加，最终结肠癌细胞的生长、增殖和迁移侵袭能力增加，作为促癌因子参与转移性结肠癌的发生发展。(2)miR-590-5p：有实验发现[33]，PTEN在结肠癌组织中低表达,而miR-590-5p与其表达成负相关，miR-590-5p通过靶向调控抑癌基因PTEN进而激活PI3K/AKT/mTOR信号网络实现促进结肠癌细胞增殖的作用，这也提示了miR-590-5p在结肠癌的病程演变过程中起着一定作用，并与其病人不良预后及后期复发转移相关。(3)miR-106b：在多种人类癌症类型中起着重要作用，特别是在侵袭和转移过程中表达显着，可以调节包含PTEN信号通路的各种重要的信号通路。在结肠癌发生及转移中，miR-106b通过抑制PTEN蛋白表达，使p-PI3K和p-AKT显著降低，但miR-106b的敲低发挥了相反的作用，并抑制了PI3K/AKT信号通路[34]。(4)miR-92a：结肠癌发生广泛淋巴转移时miR-92a显著上调，此时在靶基因PTEN相互作用下，PI3K/AKT/mTOR信号传导通路激活，致使E-cadherin下调、β-catenin和vimentin上调，进而参与EMT的调节，促进结肠癌的发生及转移[14]。又有研究报道[35]，miR-92a可通过抑制结肠癌细胞PTEN的表达，发挥促进结肠癌血管新生作用，参与结肠癌转移。(5)miR-21：是最早被鉴定为致癌基因的MiRNA 之一，目前已明确在结肠癌转移细胞中过表达，并且与淋巴结转移有关，通过抑制靶基因表达，参与肿瘤生长、侵袭和转移等特征性调控来促进转移。Zhao等[36]报道了miR-21能够通过EMT负性调节肿瘤抑制因子程序性细胞死亡因子4(PDCD4)诱导肿瘤侵袭、渗入血管最终发生转移。

4.2 MiRNA可以抑制结肠癌细胞发生及转移

(1)miR-374a：研究证实[37]，miR-374a可通过细胞周期蛋白1(CCND1)靶向调控PI3K/AKT通路抑制EMT基因，进而抑制体内外结肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移以及向肝内转移，从而避免了肿瘤发展和转移这一复杂过程。

(2)miR-7：在具有淋巴结转移的结肠癌中miR-7呈现低表达状态，其消耗会导致AKT途径相关蛋白的上调[38]，而上调的miR-7可减少PI3K、p-AKT的表达，抑制PI3K/AKT通路参与细胞增殖、迁移和侵袭，从而抑制结肠癌的转移。

(3)miR-22：夏术森[39]发现miR-22通过靶基因Sp1发挥双向负反馈调节机制作用于信号通路 PTEN/AKT，抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭及肿瘤血管生成，进而在结肠癌的发生及转移过程中充分发挥其抑癌作用。

(4)miR-195：miR-195与EMT信号传导相关，是导致癌症侵袭性表型的关键过程，也是与结肠癌转移最相关的miRNA，β-catenin途径导致高风险结肠癌中miR-195下调相关性增强，此外，Wnt /β-catenin信号转导途径与EMT密切相关，EMT是癌细胞扩散和转移的驱动力；研究发现[40]，AKT3和EZH1归因于miR-195调控的结果而miR-195会减弱WNT3A和AKT3的表达，miR-195的下调预示着结肠癌，尤其是结肠癌转移的发生。miR-195的过表达减弱了结肠癌的增殖，侵袭和迁移，而WNT3A和β-catenin的调节有助于miR-195的抗肿瘤作用，miR-195在结肠癌转移过程中作为抑癌因子存在。

(5)miR-154：BMI1作为多梳基因抑制复合体1(PRC1)家族成员可通过抑制 E-cadherin 激活Vimentin，从而促进肿瘤细胞的EMT。而BMI1在结肠癌组织中呈高表达状态，具有促癌作用。有研究证实[10]miR-154在结肠癌发生及转移过程中作为抑癌基因发挥作用，其机制是通过靶向调控 BMI1及其相关基因的转录，从而抑制结肠癌细胞的EMT活性。

(6)miR-150：徐君毅等[41]研究发现，在结肠癌细胞中miR-150过表达后HT-29细胞的抑制率和凋亡率呈上升趋势，其机制是miR-150通过阻断PI3K/AKT通路，抑制Bcl-2/Bax的表达，促进cleaved Caspase-3的表达，进而抑制结肠癌细胞发生增殖、转移等恶性生物学行为。

综上所述，不同MiRNA因子失调通过与信号通路相互作用在结肠癌发生及转移中发挥促癌或抑癌作用。基于此，我们可以通过使MiRNA恢复肿瘤抑制基因或抑制癌基因而主要参与抗癌治疗，成为抗癌治疗的新靶标。

4 总结

结肠癌转移的发生与MiRNA异常表达密切相关，其异常表达在结肠癌发生及转移这一致病过程中起抑癌或促癌的关键调控作用，PI3K/AKT/mTOR信号网络已被证实是结肠癌发生及转移最重要的信号通路之一，早期认识和支持治疗可以减少结肠癌转移的发生，我们可以通过使MiRNA恢复肿瘤抑制基因或抑制癌基因从而成为抗癌治疗中的靶标，在非转移阶段进行有效治疗进而提高结肠癌患者的生存率。由于单个MiRNA可以调节许多基因的表达，而结肠癌中MiRNA与信号网络之间关系复杂，因此了解更多参与结肠癌及转移相关的信号通路也是一个挑战，需要我们继续去探寻，进而增进我们对结肠癌潜在机制的理解，为结肠癌的治疗提供新方向、新靶点。