Th9细胞分化及与炎症性肠病关系的研究进展

赵院霞,申慧琴

【提要】 炎症性肠病(IBD)是一组病因复杂、机制未明的慢性非特异性自身免疫性疾病，发病与基因易感、肠道微生态失衡、肠黏膜屏障功能受损、肠道固有性和获得性免疫调节紊乱等有关。Th9细胞作为新发现的免疫细胞，被证实与多种自身免疫性疾病相关，白细胞介素-9(IL-9)是其分泌的细胞因子，针对IL-9抗体的研究可能是IBD治疗的新靶点。本文就近年来关于Th9细胞分化和表达IL-9的研究及他们与炎症性肠病之间的关系作一综述，以阐明其在炎症性肠病发病中的作用。

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一组病因学未明的慢性非特异性肠道炎性疾病，目前大部分研究者将其归为自身免疫性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn′s disease，CD)。既往在西方国家发病率较高，近年来流行病学数据显示我国发病率呈上升趋势[1]。炎症性肠病的病因比较复杂，容易复发，发病可能为遗传、环境或肠道微生态、免疫等相互作用。发病机制的研究有利于阐明炎症性肠病的疾病过程，寻找新的诊治靶点，为患者制定更有利的治疗方案，减轻社会负担。

免疫系统在IBD发病中起到重要作用，外界环境的刺激导致肠黏膜屏障功能受损，肠道内的免疫细胞接受到外来抗原刺激，激发固有免疫和获得性免疫。其中巨噬细胞、树突状细胞和固有淋巴细胞作为识别抗原的免疫细胞发挥作用，向T细胞和B细胞呈递抗原信息，完成免疫反应过程清除抗原。原始的T细胞在不同的细胞因子作用下可分化为不同的T细胞亚群，包括Th1、Th2、Th17、Th22、Th9细胞以及Treg细胞等[2]。不同的T细胞亚群通过其特有的途径发挥免疫功能。大量研究证实IBD与Th1、Th2、Th17参与的免疫调节有关，Th9细胞作为新近发现的CD4+T细胞亚群之一，研究表明与IBD发病有关[3]，本文就Th9细胞相关的分化影响因子及其在IBD发病中的作用进行综述。

1 Th9细胞的产生

初始Th0细胞在不同环境信号的刺激下可分化为具有不同功能和特征的亚群，正如Th1分泌干扰素γ(interferon-γ， IFN-γ)、Th2分泌白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、Th17分泌IL-17，Th9分化也不例外。研究表明，Th0细胞在IL-4和转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)联合诱导下出现一种分泌IL-9的不同于现有T淋巴细胞亚群作用的细胞，根据其分泌IL-9的特性，命名为Th9细胞[4]，IL-9是其标志性的细胞因子。也有文献报道在IL-4存在的条件下，Th9细胞也可由TGF-β作用于Th2细胞，由Th2细胞分化而来[5]。

2 Th9细胞分化

自从Th9细胞被报道以来，研究证实影响Th9细胞分化的主要转录因子有富含嘌呤盒1(purine-rich box1, PU.1)、干扰素调节因子4(interferon regulatory factor 4, IRF4)和转录因子GATA结合蛋白3(GATA-binding protein-3, GATA3)[6]，但这些转录因子并不是Th9所特有的。大量的细胞因子被证实与Th9分化有关，如肿瘤坏死因子家族OX40配体(OX40 ligand, OX40L)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand，GITRL)、肿瘤坏死因子样配体1A(tumor necrosis factor ligand-related molecule-1A，TL1A)[7]、白介素相关因子(IL-25、IL-33、IL-1、IL-6、IL-10、IL-21)[8]、一氧化氮(NO)[9]、降钙素基因相关肽(CGRP)[8]等。这表明了Th9细胞分化的复杂性及多调节性。一些细胞因子可以直接作用于IL-9基因的启动子部位发挥其促进或者抑制IL-9产生的作用，如初始T细胞经Toll样受体2(Toll-like receptors 2，TLR2)共刺激分子刺激活化后能显著调节IL-9基因，上调PU.1和B细胞激活转录因子(B-cell-activating transcription factor, BATF)表达从而增强Th9的分化和功能[10]；另一些细胞因子则需通过IL-4及TGF-β的下游通路[转录因子STAT(signal transducer and activator of transcription, STAT)通路及SMAD蛋白通路]发挥作用。

2.1 TLIA与Th9细胞分化

TL1A作为肿瘤坏死因子超家族的一员，被多项研究证实与Th9的分化密切相关[11-13]。TL1A及其受体DR3死亡受体(death receptor3，DR3)传导通过IL-2相关的STAT5通路发挥增强Th9的分化及其在过敏性肺疾病和眼部炎症中的致病性的作用；其中TL1A可以间接增强STAT5的活性[13]。TL1A-DR3还作为共刺激因子通过自分泌IL-2和STAT5诱导了不同于IL-4和TGF-β的Th9分化途径[12，13]；除此之外，在Th9条件下，TL1A还通过增强BATF、BATF3和IFR4与IL-9基因启动子的结合，从而诱导IL-9基因表达[14]。将Th9-TL1A细胞转移至Rag1小鼠的实验证实，与单独转移Th9细胞的相比，观察到严重的肠道及肺部炎症，使用抗IL-9抗体后炎症减轻[14]。提示Th9-TL1A细胞在体内具有高致病性，并且这种致病性可能依赖于IL-9的表达。以上结果表明TL1A有多种信号通路来促进Th9分化和分泌，IL-9则是发挥其导致炎症作用的关键细胞因子。除TL1A外OX40L、GITRL、Fas作为肿瘤坏死因子家族成员也对Th9分化具有促进作用。其中Fas信号通过钙离子活化蛋白激酶C(protein kinaseCβ，PKCβ)，而PKCβ进一步激活核转录因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路来促进产生IL-9的T细胞的表达[15]。

2.2 IL与Th9细胞分化

IL-25、IL-33、IL-1以NF-κB依赖的方式增强Th9细胞分化产生IL-9。同时Th9分化过程也产生IL-10、IL-13。另一项新近研究报道了IL-36γ激活髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)和NF-κB p50，诱导产生IL-9的CD4+T细胞，同时有效抑制了表达叉头框蛋白P3(forkhead box P3，Foxp3)的调节性T细胞(Treg)的发育[16]，这表明了IL-36γ可能对Th9细胞和Treg细胞之间的转化有调节作用，对其进行控制可能影响相关疾病的严重程度；IL-36γ也可以依赖于IL-2-STAT5和IL-4-STAT6途径促进Th9的分化，其中STAT5被认为是不可或缺的。实验表明IL-2不仅可以通过IL-2-JAK3-STAT5直接调节IL-9的表达，还可以通过降低B细胞淋巴瘤6(BCL6)表达来间接促进IL-9产生，而IL-21可以诱导BCL6的表达，借助BCL6发挥抑制Th9分化的作用[17]。这些结果表明，IL-2和IL-21这两种γc家族细胞因子在Th9分化中起着平衡作用，而且这种平衡作用的机制可能与BCL6和STAT5/STAT6位点的竞争性结合有关[15]。IL-2/IL-21对Th17细胞调节与Th9不同，IL-2抑制Th17细胞分化，而IL-21促进其分化[15]，这进一步提示辅助性T细胞亚群之间存在互相调节的机制。

2.3 NO与Th9细胞分化

NO作为一种自由基，其水平升高与胃肠道炎症有关[18]。Niedbala等[9]进行PCR分析证实NO加强IL-9基因的表达，减弱IL-17a的表达；进一步体外研究表明NO以抗原特异性和多克隆水平有效地促进了鼠和人Th9细胞的发育，使用抗体中和IL-2后这种促进作用被完全阻断，提示NO对Th9的作用机制。而NO对IL-2合成的机制研究表明NO通过亚硝基化Mdm2的半胱氨酸和阻断Mdm2-p53的结合来增强p53的表达，进而增强IL-2的表达，发挥其促进Th9分化的作用。细胞外三磷酸腺苷(eATP)通过诱导NO产生增强缺氧诱导因子1α(hypoxia-Inducible Factor 1-Alpha，HIF-1α)介导的代谢途径，达到诱导Th9细胞的分化的作用[19]。此外，NO对IL-2、STAT5及IRF4表达的调节提示关于Th9分化的影响因子之间互相具有调节作用，更说明各因子对Th9分化的调节具有既独立又交叉的特点。目前大多数的研究都是基于IL-4和TGF-β为条件所诱导产生的Th9细胞，Xue等[20]首次证实了TGF-β信号是可被取代的，IL-1β可以替代其与IL-4联合促进Th9细胞的分化，其中NF-κB途径对其产生IL-9至关重要，同时发现一种新的Th9细胞Th9IL-4+IL-1β cells。与经典的TGF-β诱导的Th9细胞不同，但作用相同，对于Th9细胞的分化提供新的方向，同时因其优于经典的Th9细胞抗肿瘤活性，为肿瘤治疗提供潜在的新方向。

IL-4为Th2细胞的标志细胞因子，同时也是诱导Th9细胞产生的必备因子，而且Th9细胞的主要转录因子同时表达于Th2细胞，提示Th2细胞与Th9细胞之间存在关联。然而，自从Th9细胞被单独命名以来，各项研究并未发现其独特的谱系转录因子，而是由多个转录因子共同作用的。因此关于Th9细胞是否为独立的亚群还是作为中间细胞的争论一直存在。最新的研究，Abdelazi MH等[5]进行了一项关于Th2和Th9细胞关联的研究证实，体外诱导培养Th9细胞时，在IL-4 30 ng/mL和TGF-β 5ng/mL浓度下，Th9细胞在第5天达到峰值，并观察到第3天出现Th2细胞，随后在TGF-β和IL-4共同作用下分化为Th9细胞。表明Th2细胞作为中间体在Th9细胞分化过程中起重要作用。在这个过程中伴有转录因子IRF4表达增加。该研究从另一方面阐释了Th9细胞的产生机制及其与Th2细胞之间的相互关系，并对推测可能的机制与IRF4增加有关，为研究Th9细胞的归属提供了新思路。

细胞因子之间的作用既共同又独立。大多数的细胞因子对Th9细胞分化的影响均与IL-2介导STAT5磷酸化及IL-4介导的STAT6磷酸化机制有关，而且很多因子可以同时通过这两条通路发挥其作用，这提示我们细胞因子环境信号的一致性，他们发挥作用不是孤立的，互相之间存在共同通路。但是也有特例，一项研究表明Fas诱导的Th9细胞分化与IL-2无关[15]，这提示我们细胞分化调节的差异性。

3 IL-9的表达

IL-9作为一种细胞因子早在1988年被发现，早期研究多考虑其作为Th2型细胞因子参与免疫反应，与过敏性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤相关。2008年以后被证实主要由Th9细胞产生[4]。IL-9通过与受体结合发挥作用，IL-9受体(IL-9 receptor, IL-9R)在肥大细胞、树突状细胞、巨噬细胞、气道上皮细胞、自然杀伤细胞等细胞广泛表达。IL-9是一种相对分子质量14 kD的糖蛋白，其基因分别在人类和鼠的第5号、第13号染色体上。IL-9与其受体结合后激活JAK1、JAK3，促进下游的STAT1、STAT5、STAT3磷酸化，形成二聚体进入细胞启动相关基因的转录来发挥其免疫调节作用[21]。

4 Th9细胞/IL-9与炎症性肠病

人体免疫细胞面对疾病抗原时具有进行抗原的识别和清除功能，同时免疫系统存在自我调节机制，当机体的免疫调节机制被打破后就出现免疫失衡，免疫细胞不能再识别自己，不被控制的免疫反应持续存在进而导致了一种关于免疫的疾病，称为自身免疫性疾病，涉及到人体的各个器官。IBD作为自身免疫性疾病的一种，主要分为UC和CD两种，特征为慢性反复的肠道炎症。目前，慢性肠道炎症已经在世界范围内得到重视，但是UC和CD临床症状是有区别的，其中UC的常见症状为持续或反复发作的腹泻、黏液脓血便伴腹痛，主要累及直肠和结肠，病变多连续性，弥漫分布；组织病理学除炎性细胞浸润外，以形成隐窝脓肿为典型表现；CD的常见症状为腹泻、腹痛、体重减轻，病变可累及小肠，组织病理学以局灶性的慢性炎症、局灶性隐窝结构异常和非干酪样肉芽肿为主要表现[22]。

炎症性肠病病因复杂，既往研究表明该病与肠黏膜免疫细胞密切相关，过去已被证实的Th1和Th17亚群与CD有关，Th2和UC有关。Th9细胞作为一种新的T细胞亚群，以产生高水平的IL-9为特征，IL-9信号是黏膜免疫的关键驱动因子[23-24]。一方面与多种自身免疫性疾病的发病相关，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎、过敏性炎症和IBD有关[25]；另一方面它最近被报道了抗肿瘤的特性及在寄生虫感染的保护作用[26]。Th9细胞在不同环境中可以发挥致病和保护的两种作用，这些作用的具体机制及同一环境中T细胞亚群之间相互作用不明，进一步明确这些作用机制有利于一系列相关疾病的控制。基于Th9细胞所表现出的促炎和抗炎两种相反作用，Stanko等[27]人研究发现CD96可以控制细胞因子和Th9细胞诱导结肠炎的潜能，CD96表达高低不同的Th9细胞可发挥不同的功能，他们认为Th9细胞包含有不同的子集，每个独立的子集发挥出Th9细胞的一部分作用，其中确定了CD96高Th9细胞和CD96低Th9细胞，CD96低的Th9细胞产生更高水平的IL-9，促进嗜酸性粒细胞聚集导致肠道炎症。现有多项研究已经证实IL-9在IBD患者和结肠炎模型中生物学作用[28-30]。

4.1 炎症性肠病患者中Th9/IL-9的表达

对IBD患者的研究显示，与对照组相比，UC患者活动期肠黏膜活检组织中IL-9 mRNA的表达水平增高，并且炎症越严重水平越高[30]。免疫组化分析显示相比于对照组，活动期UC患者肠黏膜表达更多的产生IL-9的T细胞[31]。同时观察到CD患者肠黏膜和对照组比较后表达IL-9的细胞被诱导表达，尽管其差异无明显统计学意义。活动期CD患者血清分析显示高水平的IL-9表达，IL-9表达水平与疾病的严重程度明显相关[32]。以上这些证明了IL-9在IBD的起病及发展过程起着重要作用。

不仅如此，UC患者肠黏膜固有层中存在表达IL-9和PU.1的CD4+T细胞。转录因子IRF4和PU.1对于Th9细胞分化表达IL-9至关重要，研究表明这两种转录因子随着UC炎症的严重程度的增加而表达增强[31]。进一步研究IL-9在IBD患者中的作用靶点显示IL-9R在IBD患者肠上皮细胞中表达升高[29]，IL-9R过度表达在功能上与UC中的抗凋亡信号相关[24]，而且伤口愈合实验显示高表达的IL-9抑制黏膜的愈合[33]。IL-9和其受体结合后可以诱导UC患者肠上皮细胞STAT5磷酸化，这与STAT5磷酸化对Th9细胞分化诱导的研究结果一致[13]。Tian等[34]证明IL-9可以增强肠屏障claudin2表达，通过STAT3/细胞因子信号传导3(SOCS3)促进UC的发病。这些研究表明IL-9可能通过对肠黏膜屏障功能的影响促进IBD的发生、发展。另一项报道称UC患者肠活检标本中IL-9蛋白过度表达，并且与IRF4和Smad3呈正相关[35]。

4.2 实验性结肠炎模型中Th9/IL-9的表达

Th9细胞和IL-9在各种实验性结肠炎小鼠的肠道中被发现表达。三硝基苯磺酸结肠炎(TNBS)诱导的结肠炎模型(模拟CD)中IL-9缺陷型小鼠的炎症较轻，对其转录因子PU.1的研究表明在IL-9缺陷型小鼠中表达较少，与噁唑酮诱导的结肠炎中IL-9基因缺陷小鼠的结果一致[29，31]。两种结肠炎模型中均证实存在Th9细胞及IL-9的受体。对TNBS小鼠的紧密连接分子进行基因分析显示缺乏IL-9刺激时Claudin1表达下调，Occludin上调而Claudin2表达无差异[36]，这与UC患者和噁唑酮诱导的结肠炎中紧密连接蛋白的表达不同，这种屏障蛋白的差异性选择表达可能是IL-9在IBD疾病过程的致病作用。使用TL1A过表达小鼠构建葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎模型，与对照组相比，TL1A过表达导致Occludin和Claudin1表达水平下降，证实了TL1A对肠黏膜屏障蛋白的抑制作用，伴有Th9细胞分化增多，IL-9表达增加，与之前的研究相符[11]。

其他研究强调了肠道黏膜中Th9和IL-9的表达，DSS诱导的结肠炎模型取得了和TNBS噁唑酮模型相同的结果，中和IL-9信号使得结肠炎小鼠的炎症减轻。另外，与野生型相比，IL-9缺陷型的小鼠体重减轻较少，炎症相对较轻[29，36]。据报道小鼠实验证明CD96表达可以抑制IL-9的产生，阻断CD96可能加重小鼠结肠炎，但是需要进一步研究其通路[27]。最新的一项过继转移实验表明转移IL-9过表达幼稚T细胞后加重了小鼠的结肠炎并伴有炎症标记物表达的增加[37]，进一步证实了IL-9在肠道炎症中的不利方面。不表达IL9受体的CD4+CD45Rb高(原始)T淋巴细胞过继后炎症被IL-9加剧，证明了IL-9可以直接作用于T细胞，不发生与受体的结合而起作用，但需在体内经抗原刺激后获得对CD44和IL-9的反应性[37]，这一结果为IL-9在炎症中调节T细胞的机制提供新的方向。

4.3 IL-9抗体的应用

Th9细胞及IL-9在IBD患者及多个实验性结肠炎模型表达增多，其表达的增加与炎症严重程度正相关，在DSS结肠炎小鼠中应用IL-9抗体的实验证实与注射盐水作为对照的小鼠相比2周后注射IL-9抗体的小鼠结肠炎症减轻[38]，因此我们推断阻断IL-9的表达有助于减轻炎症的严重程度。虽然目前关于IL-9抗体应用的研究多集中在动物模型上，但是通过拮抗IL-12/IL-23发挥作用的新型生物制剂优特克单抗(ustekinumab)已经应用于炎症性肠病患者。因此IL-9抗体有望成为另一种结肠炎症治疗的新疗法，这需要进一步从基础到临床的研究。

5 结语

IL-9作为一种细胞因子早在20年前已被发现，而Th9细胞则在10年前被正式认知，在过去的数十年里，大量研究证实其与炎症反应密切相关，导致多种自身免疫性疾病涉及到脑、肺、肠道等组织。Th9细胞和IL-9已经确定对炎症性肠病的致病作用，而多种细胞因子可以调节Th9细胞分化，这些细胞因子调节Th9细胞分化或表达的同时也影响Th9细胞作用于炎症性肠病的致病过程，针对性的抑制或者促进这些细胞因子的功能可以影响炎症性肠病的炎症水平。IL-9作为一种调节因子，其致病过程可能为抗原刺激各级免疫细胞分泌各种细胞因子通过影响Th9细胞分化和促进或者抑制IL-9的表达，作用于炎症性肠病患者和实验性结肠炎模型导致肠黏膜连接蛋白表达异常，通透性增加，进而使得肠屏障受损，细菌移位导致疾病的发生。

近年来，关于炎症性肠病治疗的新型生物制剂开发及应用备受关注。我们已经认识Th9细胞和IL-9可能作为IBD的潜在新靶点，但是关于IL-9如何对肠上皮连接蛋白发挥作用的机制尚不明确以及体内抗IL-9治疗的不确定等一些问题还有待进一步研究。通过对Th9细胞及IL-9对IBD作用机制的深入研究，寻找新的作用靶点，有望为临床患者制定新的治疗方案，减轻病情，改善预后。