microRNAs在脓毒症中的作用

闫 云综述,陈 宇，方宗平，张西京审校

0 引 言

脓毒症是感染引起宿主免疫反应失调，进而导致危及生命的器官功能障碍[1]。脓毒症死亡率居高不下，实现早期诊断，以采取合适的治疗措施至关重要。血培养是诊断脓毒症的金标准，但在脓毒症患者中，血培养阳性率仅有30%～40%[2]。同时，血培养结果具有延迟性，常导致临床上经验性应用广谱抗生素，进而造成多重耐药菌。此外，由于脓毒症诊断不及时，相关的液体复苏等治疗措施跟不上，不良后果增加[2]。因此，实现早期准确诊断脓毒症非常重要。目前许多研究发现miRNAs参与脓毒症的病理生理过程，并提出将其作为脓毒症生物标志物应用于临床的可能。

1 传统生物标志物在脓毒症诊断方面的局限性

多种生物标志物可用于脓毒症的辅助诊断，例如，降钙素原(procalcitonin，PCT)、脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)、可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体(Serum soluble urokinase-type plasminogen activator receptor，suPAR)和可溶性髓样细胞触发受体1(soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1，sTREM-1)等，但各自均有相应的局限性[3]。

PCT对区分细菌和病毒感染的特异性较高[4]；但其他炎症反应如手术、自身免疫性疾病、副瘤综合征、长时间休克、慢性寄生虫疾病、一些免疫调节药物以及重大创伤等也可引起PCT升高，且PCT不能准确区分感染和非感染因素导致的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，同时其检测周期较长[5-6]。suPAR与脓毒症预后不良直接相关[7]，然而任何一种可出现全身炎症反应的病理状态均可导致suPAR升高，对脓毒症诊断的灵敏度和特异性均较低(Sen:0.73; Spe:0.79)，无法区分SIRS和脓毒症[8-9]。sTREM-1可区分早期脓毒症和SIRS，但sTREM-1仅能够预测炎症的存在，而无法区分其是由感染或非感染造成的，更无法区分严重脓毒症和脓毒症休克(Sen:0.73; Spe:0.79)[8,10-11]。LBP无法区分革兰阴性细菌感染与革兰阳性细菌感染以及不同严重程度脓毒症(Sen:0.84; sep:0.78)[12-13]。

2 miRNA的生物学特征

miRNA是进化上保守的单链非编码RNA，20～25个碱基长度，通过沉默或降解mRNA来调节蛋白质表达，在基因转录后修饰中发挥作用[14]。从分子角度来看，miRNA在细胞核合成，通过RNA聚合酶II与特定基因的结合发挥作用。首先，合成初级miRNA，接着，miRNA聚合酶III核酸内切酶，也叫RNase III核酸内切酶((Drosha)，在DGCR8(DiGeorge critical region-8)复合物的催化下激活初级miRNA，促使前miRNA形成。前miRNA形成后会结合Exportin-5转运蛋白将其从核内转到细胞质[14]。在细胞质中，由RNA聚合酶III核酸内切酶和 RNA 结合蛋白 (TAR RNA binding proteins，TRBP)共同发挥作用，促进最终miRNA的形成。最后在RNA介导的沉默复合体的参与下，miRNA会以不同的机制和不同方式如核糖体复合物、微囊泡、外泌体、高密度脂蛋白等转出细胞[14]。目前在动物、病毒、植物中已发现了成千上万的miRNAs，在人类中也发现了600多种[15]。

3 miRNAs对脓毒症病理生理过程的调节

Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)信号通路与脓毒症的发生发展密切相关，miRNAs在转录后水平靶向调节TLR通路相关分子的基因表达，进而参与脓毒症的调节，是脓毒症信号通路的关键内源性调节因子[16]。脓毒症的发生与免疫系统全面激活有关，而TLR对宿主免疫应答的启动必不可少，TLR介导的信号通路在脓毒症中的作用已被广泛研究[17-18]，抑制TLR信号通路可在一定程度上减轻脓毒症[19]。每种miRNA 可调节上百种不同的mRNA，miRNA直接降解mRNA是TLR信号通路最高效的调节方式[16]。TLR识别脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)或内毒素，募集衔接蛋白髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88，MyD88)，MyD88招募白细胞介素1受体相关激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK1)、IRAK2 和IRAK4[20]。IRAK4、IRAK1和IRAK2可以激活肿瘤坏死受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)，TRAF6够使IKK复合物的β亚基被TAK1(TGF-β激活性激酶1)去磷酸化，进而激活IκB激酶( inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK )复合物，包括IKK-α、IKK-β和IKKγ[20]。IKK复合物能够被TAK1磷酸化NF-κB抑制蛋白α(inhibitor α of NF-κB，IκBα)，释放NF-κB转录因子P50和P65异源二聚体转入核内，从而促进促炎因子的产生[21]。

3.1miRNAs调节TLR4基因表达参与调节TLR4的miRNA包括：let-7 家族、miR-146b、miR-140、miR-17-5p。miRNA的不同表达与TLR在不同免疫细胞的分布有关[16]。let-7家族调节TLR4 mRNA[18]。miRNA Let-7i过表达可以降低人类胆管细胞TLR4水平，巨噬细胞内转染let-7e的反义miRNA能上调TLR4进而增加炎症因子的释放[22]。有研究证明，TLR4是miR-140的靶基因，miR-140下调可促进TLR4激活[23]。HEK293细胞的荧光酶报告证明，转染miR-146b后TLR4的3’非编码区(Untranslated Regions，UTR)活动减少，证实miR-146b也靶向调控TLR4[24]。五味子素能增加 miR-17-5p的表达，促进炎症反应，减少脓毒症小鼠和脂多糖诱导的巨噬细胞中TLR4的表达[25]。这些研究均表明miRNAs调控TLR4的表达及功能，从而影响脓毒症的病理生理过程。

3.2miRNAs调节MyD88基因表达MyD88的表达受miR-200b和miR-200c的调节[26]。miR-149在RAW264.7细胞中的过度表达与MyD88蛋白表达降低及炎症介质NF-κB、TNF-α和IL-6的产生减少有关，荧光素酶报告系统进一步证明miR-149可直接靶向MyD88 mRNA的3’-UTR从而调节Myd88表达[27]。miR-203的过表达抑制巨噬细胞内MyD88翻译[28]。miR-124转染的RAW.7细胞可分别在转录和蛋白层面下调Myd88表达[29]。在HEK293细胞中，miR-155可以在蛋白水平降低MyD88的表达，表明其对MyD88的抑制作用发生在转录后[30]。

3.3miRNAs调节IRAK1和 TRAF6基因表达miR-146a和miR-146b可负向调控IRAK1和TRAF6[31]。有研究表明miR-146家族参与NF-κB依赖的免疫应答，LPS刺激可导致THP-1细胞中miR-132、miR-155 和miR-146表达明显上调，通过荧光酶报告进一步检测IRAK1和TRAF6 3’-UTR的活动，发现miR-146a和miR-146b活动减少[31]。miR-146a可直接靶向IRAK1和TRAF6的mRNA，并通过对IRAK1和TRAF6的抑制来降低促炎细胞炎症因子的分泌[32]。

3.4miRNAs调节IKK复合物基因表达miR-15、miR-16、miR-223、miR-199a和miR-218参与对IKK复合物的调节。IKK复合物包括IKK-α、IKK-β和IKKγ，其对NF-κB的激活有重要作用[14]。IKK-α负反馈调节单核巨噬细胞的分化[33]。miR-223可抑制mRNA翻译或减少p62产生来抑制IKK-α，也就是说抑制miR-223可增加IKK-α和p62蛋白表达，进而激活NF-κB的下游通路[33]。IKK-α的升高也伴随miR-15a、miR-16表达降低[33]。IKK-β与miR-199a序列部分互补，可降低卵巢癌细胞中IKK-β表达[34]。miR-218过表达可减轻肾脏炎症反应，使IL-6、IL-1β等炎症因子产生减少，且miR-218靶向调节编码IKK-β的mRNA，均证明了miRNAs对TLR信号通路的调节[35]。

3.5miRNAs靶向调控促炎因子TNFαTLR4介导的NF-κB激活释放的TNF-α也可被miRNA靶向调控[36]。研究发现miR-221、miR-579和miR-125b序列与TNFα的3‘UTR 序列互补，因此将它们列为可调节TNF-α的候选miRNA[36]。在LPS耐受的THP-1细胞中，miR-579、miR-221和miR-125抑制TNF-α表达[36]。转染miR-221可在mRNA水平促进TNFα的降解，而转染miR-579和miR-125b能在蛋白质水平造成TNFα的显著减少[36]。同时有研究也报道了miR-125b对TNFα的抑制作用，在HEK-293细胞中，当miR-125b和TNFα的3’UTR共转染时，荧光酶活动减少，表明miR-125b上调伴随TNFα表达下调[37]。miRNA-130a能下调TNF-α和内皮素1(endothelin-1，ET-1)表达，并改善心力衰竭大鼠的症状[38]。

总之，大量研究证实，miRNAs高度调控免疫细胞中TLR介导的信号通路中的多个环节，进而调节脓毒症的发生发展。这是将miRNAs应用于脓毒症的基本前提。

4 miRNAs在脓毒症诊断及预后中的应用

除了调节基因表达，研究表明循环中的miRNAs有作为脓毒症生物标志物的潜在价值[39]。miRNAs参与脓毒症病理生理过程中的多个环节，变化明显的miRNAs有助于脓毒症的诊断及预后评估[39]。以下分别阐述目前研究较多的miRNAs在脓毒症诊断及预后中的价值。

4.1miR-150LPS刺激可导致白细胞中miR-150下降，已证实在脓毒症不同阶段，miR-150有不同程度的降低[40]。另外一项研究通过对比12例健康人和10例脓毒症患者血清miRNA发现：两组miRNA150的表达均明显下调；而脓毒症患者中miR-150下调伴随促炎因子IL-18的升高[41]。但另有研究发现miR150表达只有轻微降低，且低水平miR-150的患者发生多脏器衰竭的风险更高[41]。血浆 miR-150表达降低也与肾功能障碍和28天生存率相关[41]。LPS刺激后，miR-150在脐静脉内皮细胞的表达明显下调，而过表达miR-150能减轻LPS导致的炎症反应[42]。外周白细胞 miR-150低表达与泌尿道革兰阴性菌感染造成的脓毒症有关[43]。早期判断脓毒症的严重程度对其后续治疗至关重要[44]。miR-150的变化不仅与脓毒症的严重程度相关，可区分脓毒症和全身炎症反应综合症，同时低水平miRNA150的患者预后更差。而传统生物标志物sTREM-1虽可区分早期脓毒症和SIRS，但sTREM-1仅能够预测炎症的存在，而无法区分其是由感染或非感染造成的，更无法区分严重脓毒症和脓毒症休克[10-11]。

4.2miR-223miR-223是位于X染色体上高度保守的miRNA，在骨髓谱系中特异表达，促进祖细胞向髓系细胞分化，以维持粒细胞的功能，并参与调节造血功能、免疫反应以及不同类型的炎症，如炎症性肠病、类风湿关节炎等[45]。miR-223在髓样细胞，尤其是中性粒细胞和巨噬细胞的分化和激活中起着核心作用，可通过抑制IKK-α和p62表达进而抑制NF-κB信号通路并阻止巨噬细胞的活化，同时负性调节TLR介导的炎症因子的释放[45]。通过研究50例脓毒症患者，30例SIRS患者和20例健康对照者血清miRNAs的表达，发现miR-223在脓毒症中明显降低，且AUC-ROC可达0.85，而在SIRS中无明显变化，鉴于miR-223可以明确区分脓毒症和SIRS，故其更适合用于脓毒症的诊断[46]。Wu等[47]纳入脓毒症患者187例，健康人186例，发现miR-223除在脓毒症患者中降低外，还与TNFα、IL-1b、IL-6和IL-8正相关，与IL-10负相关，这可能与miR-223靶向多种基因和信号途径激活炎症反应，促进炎症因子的释放从而进一步加重脓毒症有关。同时吸入直接靶向肺泡上皮细胞的miR-223模拟物或可作为缓解ARDS炎症的治疗方法[48]。

4.3miR-4772miR-4772家族在脓毒症的诊断和预后评估方面有一定价值，包括miR-4772-3p、miR-4772-5p、miR-4772-5p-iso[49]。Ma等[49]纳入23例脓毒症患者，22例SIRS患者和21例健康人分析得出：miR-150是唯一可以区分健康人和脓毒症不同分期的miRNA，并且提出miR-150 与miR-4772 结合诊断脓毒症的准确性更高。miR-4772-5p-iso位于IL-18受体辅助蛋白基因(interleukin 18 receptor accessory protein，IL-18RAP)的内含子区域，IL-18在脓毒症患者中升高，故miR-4772-5p-iso与脓毒症也存在一定关系[50]。

4.4其他miRNAsmiR574-5p可评估患者预后，其表达与脓毒症死亡率密切相关，miR-297与脓毒症存活率相关[51]。Tacke等[52]发现脓毒症患者miR-133a明显升高，且其升高与肾损害、肝损害、血清PH、血清乳酸水平及升压药物用量密切相关。非存活患者的miR-133a明显高于存活患者，且高miR-133a患者预后明显不良[52]。Wang等[53]发现血清中4种miRNAs标记物miR-15a、miR-16、miR-193 和miR-483-5p的组合以及脓毒症床评分预测28天生存率灵敏度可达88.5%，特异性为90.4%。而PCT虽对区分细菌和病毒感染的特异性较高，但其诊断脓毒症的灵敏度仅为50%，且PCT不能准确区分感染和非感染因素导致的SIRS4。miR-887-3在脓毒症同时伴有急性呼吸窘迫综合征的患者中明显升高，miR-887-3p可上调ARDS相关基因，并释放炎症因子和趋化因子促进ARDS的发生[54]。

目前miRNAs检测手段已比较成熟，方便快捷[55]；不仅可区分脓毒症和SIRS，同时可鉴别脓毒症的不同严重程度，其特异度和灵敏度高于PCT和CRP等传统生物标志物[56]；以上均表明miRNAs在作为脓毒症诊断和预后评估的生物标志物方面具有重要价值[57]。

5 结 语

综上所述，miRNAs不仅可以在基因层面通过调控TLR信号通路来调节脓毒症的发生发展，同时也可作为脓毒症诊断及预后评估的生物标志物，减少因脓毒症诊断不及时而造成的诸多不良后果。此外，靶向调控miRNAs可延缓脓毒症进展。但是miRNAs作为脓毒症生物标志物在临床中的应用尚需进一步研究