上皮-间质转化参与肺纤维化过程的研究进展

张宇豪综述，杨志洲审校

0 引 言

肺纤维化是一种复杂的肺间质性疾病，是众多肺部疾病的最终表现形式[1]。早期表现为弥漫性肺炎，后期发展为成纤维细胞过度增生和细胞外基质(extra-cellular matrix, ECM)过度沉积，预后一般较差，具体发病机制尚未明确[2-3]。目前已证明遗传和环境危险因素导致肺上皮损伤和功能障碍是启动致病过程的中心[4]。国内外研究普遍认为，肺泡上皮细胞的损伤、肺泡上皮和成纤维细胞相互作用以及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肺纤维化发病机制中的关键[5-7]。EMT通过其上游相关信号通路引起纤维化效应，干预或阻断EMT的相关效应分子，可抑制肺纤维化的发生发展方向。随着分子生物学技术的不断进步，近年来研究人员发现内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)、自噬与EMT相关基因表达之间关系密切。本文就EMT在肺纤维化中的研究进展作一综述。

1 EMT概述

EMT是上皮细胞失去连接黏附性和尖-基极性，使细胞骨架发生显著变化，从而改变细胞外在形状，并获得ECM侵袭、迁移和产生间质等特征的生物学过程[5,8]。EMT是正常胚胎发育所必需的生理过程，通常是可逆的，但其也存在于对损伤、癌变和纤维化的反应过程中[5,9]。EMT的存在是通过检测几种生物标志物来确定的，这些生物标志物反映上皮表型的丧失和间充质细胞的再生，即与细胞连接相关的蛋白质(E-cadherin的减少和N-cadherin的增多)、细胞骨架蛋白(细胞角蛋白的减少和波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、结蛋白和纤维连接蛋白的增多)以及原始细胞分泌的管腔蛋白(如表面活性物质的产生减少和细胞外基质或金属蛋白的增多)[9]。

传统观点认为，EMT有三种不同的功能类型：Ⅰ型与胚胎发育过程中参与组织和器官形成的生理过程有关；Ⅱ型涉及正常伤口愈合，并且在IPF中的过度组织修复中起作用；Ⅲ型提示恶性上皮细胞获得与肿瘤侵袭和转移相关的迁移表型[10]。EMT受多种细胞外配体的调节，如转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、IL-1、结缔组织生长因子、胰岛素样生长因子-2(insulin-like growth factor-2，IGF-2)、核因子-kB和Wnt等，这些生长因子根据其分泌的环境具有不同的作用。在存在IGF2的情况下，β-catenin(将细胞骨架与粘附连接相连接的蛋白质)在细胞表面从E-cadherin上解离，并重新分布到细胞核中[11]；FGF2被认为是在肾细胞中诱导EMT的潜在因子，并刺激与基底膜降解有关的MMP2和MMP9的分泌[12]。这些配体与表面受体结合后启动细胞内信号级联反应[5,13]。这些途径可激活一个或多个EMT驱动的转录因子，如Snail1、Snail2、Twist1、Zeb1和Zeb2，这些转录因子可直接或间接下调E-cadherin等黏附分子的表达[13]。此外，细胞环境和多效性信号(如活性氧)在导致EMT的不同信号通路中也发挥了作用[13-14]。

TGF-β是EMT中研究最多的生长因子之一，主要是通过Smad信号通路。即与表面受体结合后，诱导两个受体的二聚化和随后的自身磷酸化，导致Smad2和Smad3的激活。Smad2/3二聚体与Smad4形成复合体，移位到细胞核中，参与靶基因的转录调控[15]。Smad复合体通过Snail1和Snail2转录因子抑制E-cadherin的表达，从而诱导N-cadherin、纤维连接蛋白和金属蛋白酶等间充质蛋白的表达。此外，TGF-β/Smad信号通过诱导Twist、Zeb1和Zeb2的表达间接驱动EMT的转录反应，并与Wnt等其他EMT信号通路重叠[15-16]。

Wnt/β-catenin信号途径，也称经典Wnt信号通路，是一种进化上保守的细胞信号系统，在器官发生、组织动态平衡和许多人类疾病的发病机制等多种生物过程中发挥重要作用[17]。β-catenin是这一信号转导过程中的关键调节因子，当细胞未接受Wnt信号刺激时 (Wnt Off)，细胞质内的Axin、APC和GSK3β形成降解复合体，与β-Catenin结合并使其被磷酸化后，最终通过泛素化修饰而降解[18]。在Wnt激活过程中，Dvl是一个重要的效应分子，当Wnt与其膜受体FZD结合后(Wnt On)，激活胞内蛋白Dvl并抑制GSK3β等蛋白形成的β-Catenin降解复合物的降解活性，稳定细胞质中游离状态的β-Catenin蛋白。胞浆中稳定积累的β-Catenin进入细胞核后结合LEF/TCF转录因子家族，启动下游靶基因 (如C-myc、Cyclin D1等) 的转录[19]。

2 肺纤维化中的ERS

内质网是负责维持蛋白质体内稳态或“蛋白稳态”的专门细胞器。内质网主要负责蛋白质折叠和在蛋白质到达细胞内或细胞外目标点之前进行质量控制。任何干扰蛋白质加工的条件都可能导致错误折叠的蛋白质在内质网中积聚，这种情况称为ERS。针对ERS，细胞会启动对应信号级联反应，称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。UPR可帮助细胞消除内质网中蛋白质积累的不利影响以恢复蛋白稳态，当UPR机制失效或者ERS过重则会导致细胞凋亡[14]，并且大多数与疾病发病机理相关的研究都集中在细胞凋亡作为ERS与疾病之间的联系上。慢性ERS是导致多种疾病的关键因素，包括神经退行性疾病，糖尿病，癌症和代谢性疾病[20]。

ERS与纤维化疾病，包括特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)的发生和发展有关。二者之间的潜在联系可追溯到多年前肺纤维化的家族性病例研究中，因发现表面活性蛋白的突变而首先进行描述的。家族性IPF是由Ⅱ型肺泡上皮(alveolar epithelium cell Ⅱ，AEC Ⅱ)产生的表面活性蛋白C(surfactant-associated protein C，SFTPC)突变所造成的[21-22]。当突变的SFTPC结构在肺上皮细胞中表达时，其结果是突变蛋白在内质网中的积累和ERS的诱导[23-25]。目前已知常见的环境暴露(如疱疹病毒、吸入颗粒物和香烟烟雾)会诱发ERS。近年来也有研究表明，衰老是IPF发展的主要辅助因子。有证据表明老年肺在损伤后发生肺纤维化的风险更大[14]。这可能与年龄的增长，UPR反应受损和泛素蛋白体介导的降解途径中年龄相关的损伤中促凋亡信号增加有关[26]。

一直以来，EMT被认为通过增加负责胶原生成和基质沉积的细胞数量，促进了包括肺在内的许多器官的纤维化重塑[27-29]。已有研究表明，存在两种不同的方式诱导ERS：①稳定表达L188Q SFTPC基因突变(突变型SFTPC)；②暴露于衣霉素，一种能破坏内质网蛋白糖基化的抗生素。无论何种方式诱导ERS，均会导致EMT。这种作用是通过Smad2/3和Src激酶的激活介导的，并且在ERS诱导条件停止后是可逆的，但是，将UPR途径与Smad和Src激活联系起来的确切机制尚需进一步研究[24]。后续的研究表明，UPR的信号通路可能涉及PERK /eIF2α/ATF4途径、IRE1/XBP1途径及ATF6途径[20]。

后来发现，UPR途径由3个内质网跨膜蛋白组成：PERK、ATF6、IRE1α。在非ERS的细胞中，结合免疫球蛋白(immunoglobulin binding protein，BIP)是促进蛋白质折叠的伴侣蛋白，其仍然与PERK、ATF6和IRE1α结合，并使这些感受器处于非活动状态。在蛋白质积累的应激细胞中，BIP与感受器呈隔离状态，导致这些感受器的激活和UPR的启动[30]。

最新的研究发现，局部肺泡缺氧可能是散发性IPF引起的AEC内质网应激和随后的UPR激活的重要触发因素[31-32]。缺氧和受损AEC的微环境可通过诱导EMT引发上皮细胞功能障碍，同时确定了ERS和内质网环境中存在的Ca2+是控制受损细胞命运的关键因素[33]。此外，已有报道在缺氧的血管内皮细胞内存在钙调节，这可能与EMT特征性诱导有关。低氧也可能导致内质网钙耗竭，从而引发ERS[34]。体外研究也表明，促凋亡转录因子CHOP(CCAAT/enhancer-binding protei-homologous protein)需要通过IRE1α和PERK途径调节缺氧诱导的AEC细胞凋亡。在人类IPF肺中，Ⅱ型AEC中的CHOP和缺氧标志物均被上调，从而得出结论：局部缺氧导致ERS诱导的CHOP表达，从而增强Ⅱ型AEC凋亡并增强肺纤维化[31]。

综上所述，内质网腔内未折叠蛋白的积累导致ERS，针对ERS，BIP从ERS转导系统解离，并与未折叠和错误折叠的蛋白质结合，导致ERS转导系统激活：PERK、IRE1和ATF6。PERK的激活增加了eIF2的磷酸化，导致蛋白质合成的减弱和ATF4翻译的增加。在长时间的应激过程中，ATF4可诱导促凋亡转录因子CHOP的表达；IRE1的激活，剪接XBP1产生活性形式XBP1-S(剪接XBP1)，其上调BIP和参与内质网相关蛋白降解(ER-associated protein degradation，ERAD)的蛋白；激活的ATF6在转录上诱导ERAD基因并上调CHOP的表达。低氧微环境可诱导具有EMT特征的原代血管内皮细胞表型发生改变，导致ERS诱导的CHOP表达，从而增强Ⅱ型AEC凋亡并增强肺纤维化。

3 肺纤维化中的自噬

自噬是一种进化保守的细胞程序，用于通过溶酶体依赖的降解途径来转化细胞器和蛋白质。根据底物进入溶酶体的不同方式可分为：巨型自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。在最常见的自噬形式(巨型自噬)中，胞液物质被隔离在称为自噬小体的双膜室中，然后融合到溶酶体中，在溶酶体中被其内容酶所降解。在此过程中，数十种蛋白质是由自噬相关基因(autophagy related gene，ATG)形成的，其产物通过形成不同的蛋白质复合物来介导自噬[35]。

自噬可减轻细胞应激的影响，将受损或加工不当的蛋白质和细胞器运送到溶酶体进行降解，从而提供代谢燃料，特别是在能量供应不足的时期。但是过度的自噬会引发细胞程序性死亡。内质网协调蛋白质折叠，但当对蛋白质的需求超过蛋白质合成的能力时，将会诱导UPR。这触发了ERS级联反应，促进了新翻译蛋白质的有效细胞处理，并恢复了内质网的稳态。如果UPR不能恢复蛋白质处理的动态平衡，可驱动细胞凋亡的信号，从而防止过度的组织损伤[14]。

越来越多的研究发现自噬在维持细胞内环境的稳定性中起重要作用。近年来研究表明，自噬与IPF的发病机理有关，细胞自噬和细胞凋亡之间的平衡是IPF的重要调节因素[36]。细胞凋亡与自噬之间存在相互作用，在肺纤维化过程中，成纤维细胞凋亡不足成为重要的致病过程，并且自噬可促进人肺成纤维细胞中TGF-β1的纤维化作用[37]。该团队研究了自噬和UPR在TGF-β1诱导的人非IPF和IPF供者肺成纤维细胞的促纤维化效应中的关联和作用[37]。另外，对特定ATG作用的研究得出了不同的结果，这对于伤口修复和组织重建有着不同的影响[38]。这种差异可能是由于针对自噬调节目标的不同所造成的。然而，肺纤维化背景下这些联系尚未阐明。

目前公认的是，自噬和EMT是癌症发生和发展的主要生物学过程，这两个过程之间存在复杂的联系。一方面，细胞在EMT过程中依赖自噬激活生存。另一方面，自噬起到了抑制肿瘤信号的作用，阻碍了转移的早期阶段和EMT的激活。因此，通过靶向自噬来调节EMT是治疗癌症的一种非常有前途的策略[39-40]。目前已知在癌症中EMT是有害的，而在伤口愈合中，EMT作为对损伤的反应是有益的。然而，如果过度的伤口修复，则可能会导致纤维化[41]。最近的一项研究表明，自噬抑制介导的EMT增强肺纤维化中成纤维细胞的局部分化。自噬抑制通过肺泡上皮细胞中p62/SQSMT1-NFκB-Snail2通路诱导EMT，并对衰老的肺泡上皮细胞进行局部微损伤，导致肺泡上皮细胞持续激活，分泌大量的促纤维形成因子，驱动局部成纤维细胞分化[3]。进一步的研究发现促炎细胞因子，如TNF-α，可下调自噬并增加ROS水平，从而拮抗TGF-β2诱导的EMT，这表明自噬通过调节ROS水平在促进EMT中起前体作用，而TNF-α可通过抑制自噬来抑制EMT[39]。

目前，吡非尼酮和Nintedanib是FDA批准的仅有的两种治疗肺纤维化的药物。Nintedanib通过下调ECM分泌并抑制TGF-β信号传导发挥抗纤维化作用，并诱导依赖Beclin-1、不依赖ATG7的自噬[42-43]。此外，ATG4b是调节自噬的重要因素。当ATG4b基因被敲除时，支气管和肺泡上皮细胞的损伤加重，细胞凋亡率增加[44]。这些研究表明，抑制TGF-β信号转导和通过靶向自噬来调节EMT可能是IPF未来的治疗方向。

4 结语与展望

综上，EMT是肺纤维化发病机制中的关键步骤，其可被看作是一种极端的细胞可塑性，特征是上皮标志物的丢失、细胞骨架的重组以及在获得间质标志物的同时过渡到纺锤形的形态。TGF-β信号通路作为EMT的核心，与Wnt等信号通路共同调节EMT介导的肺纤维化过程。通过研究EMT的分子机制及调控因素，有助于更清晰地阐明肺纤维化的发生发展机制。当前主流观点依然认同EMT在肺纤维化发生发展中的重要地位，并且EMT重要效应分子TGF-β作为肺纤维化的药物治疗靶点已经取得较好的突破。因此与EMT有关的调控机制可作为进一步研究肺纤维化防治的思路。而鉴于Wnt/β-catenin信号转导与纤维化疾病有关，目前有多种Wnt途径抑制剂为我们提供了潜在的治疗可行性。除此之外，CHOP是内质网应激诱导细胞凋亡的重要分子介质，也可能调节肺纤维化中AECs的其他重要促纤维化功能，所以CHOP及其下游靶点可能是IPF治疗策略的新型靶点。当前有效治疗肺纤维化的药物Nintedanib可诱导ATG7独立性的自噬。同时ATG4b是调节自噬的重要因素。因此，ATG途径的调控可能成为未来一种合适且有前途的治疗策略。