脓毒症骨骼肌萎缩机制的研究进展

殷丹丹，吴进，蒋鹏

(1.江苏大学附属医院麻醉科，江苏 镇江 212001； 2.江苏大学医学院，江苏 镇江 212001)

脓毒症是一种以全身炎症反应和组织损伤为特征的临床综合征，可导致机体循环衰竭、多器官功能障碍甚至死亡，是危重症领域的重大难题之一，每年影响全世界数百万人的健康，甚至危及生命[1-2]。脓毒症时，急性分解代谢反应可导致机体能量储存快速动员(包括肌肉、糖原和脂质储存被分解)，驱动糖异生[3]。其中，骨骼肌占人体细胞质量的50%～60%[4]，是受高分解代谢影响最大的组织。分解代谢刺激的持续存在显著影响骨骼肌间室的稳态，导致呼吸肌及四肢运动肌肉萎缩、瘦体重快速降低，同时产生呼吸肌效率低下、通气不足、呼吸衰竭、脱机困难、肌肉关节功能障碍、运动受限等严重临床并发症，甚至危及生命[5]。临床诊疗过程中，医护人员常通过调整患者饮食结构、营养支持治疗、肌肉关节功能锻炼等方法预防和治疗骨骼肌肉萎缩，但效果并不显著。研究表明，蛋白质降解水平升高、合成水平降低是导致脓毒症骨骼肌萎缩的重要原因[6-7]。但激素、炎症因子、氧化应激等因素对脓毒症骨骼肌萎缩的潜在作用机制目前尚未完全阐明，且对骨骼肌萎缩的深入研究仍存在诸多争议。现就脓毒症骨骼肌萎缩机制的研究进展予以综述。

1 蛋白质降解

蛋白质降解在细胞生物活动中占重要地位。骨骼肌蛋白质降解途径主要包括泛素-蛋白酶体系统、自噬-溶酶体途径、钙蛋白酶和胱天蛋白酶(caspase)，在脓毒症肌肉萎缩中起主要作用的是泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体途径[8-9]。

1.1泛素-蛋白酶体系统 泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要途径。泛素修饰是一个由泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3三种酶进行的ATP依赖性过程，首先由E1激活泛素，然后活化的泛素与E2结合，再由E3将泛素的活化形式从E2转移至底物的赖氨酸残基上；E3能识别底物N端残基、特定的磷酸化域或破坏盒，是底物特异性的主要决定因素，在确定蛋白酶体降解目标蛋白方面起重要作用[10]。最后，经过多聚泛素链标记的蛋白质被多亚基26S蛋白酶体(由核心亚基20S和两端调控复合体19S组成)识别并降解[11]。

骨骼肌中存在两种肌特异性E3泛素连接酶，即肌肉萎缩盒F蛋白(muscle atrophy F-box，MAFbx)和肌肉环指蛋白1(muscle ring finger protein 1，MuRF1)。有研究发现，在盲肠结扎穿孔脓毒症模型中，大鼠萎缩的趾长伸肌腱中的MAFbx、腓肠肌中的MuRF1信使RNA表达量分别增加10倍和4倍[12-13]。由此推测，机体感染脓毒症时MAFbx和MuRF1基因表达增加，肌萎缩程序启动，导致泛素-蛋白酶体系统激活，肌肉蛋白降解。

机体中的肌纤维可分为快肌纤维和慢肌纤维，这种肌纤维的差异性导致肌萎缩程度不同。Morel等[14]在小鼠脓毒症模型中发现，与膈肌相比，四肢运动肌肉更易发生肌肉萎缩，这与脓毒症四肢运动肌泛素-蛋白酶体系统活化有关。盲肠结扎穿孔术后1 d，SD大鼠腓肠肌和膈肌中MuRF-1、MAFbx信使RNA的表达水平均显著升高，但腓肠肌的转录应答显著高于膈肌，主要原因为呼吸肌中慢肌纤维的比例和线粒体密度均高于运动肌，因此其抗氧化代谢能力是四肢肌肉的数倍，所以在大鼠的肌萎缩中，与运动肌相比，呼吸肌更具萎缩抵抗性[15]。

1.2自噬溶酶体途径 自噬-溶酶体途径主要负责细胞质蛋白和细胞器的降解,包括线粒体和过氧化物酶体等。根据细胞物质运送至溶酶体途径的不同，自噬可分为巨自噬、分子伴侣介导的自噬和微自噬，其中只有巨自噬参与肌肉萎缩[16]。巨自噬(简称自噬)是一种基因调控、高度保守的细胞降解过程，由内质网来源的脂膜包绕待降解物质形成自噬小体，然后与溶酶体融合并降解其内容物，以满足细胞自身能量代谢需求并更新老化、损伤的细胞器。机体感染脓毒症时，部分器官系统的自噬水平会发生显著改变。研究证实，自噬在各脏器系统中发挥不同的作用，但在骨骼肌中自噬导致肌肉萎缩的作用机制还存在争议[17]。

在自噬膜起始阶段，UNC-51样激酶(UNC-51-like kinase，ULK)-1与自噬相关蛋白13、FAK家族互作蛋白200形成复合物，受AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)双重调控，调节机体自噬水平；恶病质时，AMPK可磷酸化ULK-1丝氨酸555位点，激活自噬，但在营养充足状态下，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)可磷酸化ULK-1丝氨酸757位点，干扰ULK-1与AMPK的交互作用，抑制细胞自噬[18]。Stana等[8]研究证明，与膈肌相比，脓毒症小鼠胫骨前肌萎缩的持续时间更长，且与胫骨前肌中高水平自噬有关。由此认为，脓毒症时机体自噬-溶酶体途径的持续激活是导致肌肉萎缩的原因之一，自噬-溶酶体途径通过抑制mTOR激活AMPK相关信号通路，诱导骨骼肌高水平自噬，促进脓毒症肌纤维萎缩。而Chen等[19]认为，激活自噬有利于清理功能失调的细胞器和有毒的损伤蛋白质，防止由损坏的细胞器积累导致的肌肉萎缩和功能障碍，相反，抑制骨骼肌自噬可导致神经肌肉功能障碍。还有研究表明，出现败血症、癌症等恶病质状态时，机体可通过c-Jun氨基端激酶途径诱导B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)磷酸化，导致Bcl-2失活并与Beclin-1蛋白解离，发挥诱导自噬的作用[20]。Bcl-2与Beclin-1蛋白的BH3结构域结合，以复合物形式调控自噬体成核阶段，在正常生理条件下，Bcelin-1、Bcl-2结合稳定，维持细胞稳态，而处于应激状态时，Bcl-2的丝氨酸70、87和酪氨酸69位点发生磷酸化，Bcl-2与Beclin-1解离，诱导细胞自噬[21]。微管相关蛋白1轻链3B、ULK-2、自噬相关蛋白12、Beclin-1等自噬不同阶段相关基因均受叉头框蛋白(forkhead box protein，Fox)O3转录因子的调节[9,22]。在C2C12细胞来源的肌管、离体小鼠肌肉或肌纤维中，过表达FoxO3可增加自噬小体形成，而特异性敲除FoxO3则可抑制自噬[23]。另外，外源性补充亮氨酸等必需氨基酸，可通过抑制骨骼肌自噬信号通路，预防脓毒症引起的肌肉蛋白降解[24]。综上可知，发生脓毒症时机体骨骼肌系统过度自噬是有害的，自噬-溶酶体途径与其他蛋白质降解途径可发挥协同作用，导致机体肌肉萎缩。

1.3钙蛋白酶和caspase 细胞内Ca2+主要贮存于肌细胞线粒体和肌质网，作为第二信使，介导细胞内信号转导，产生生物学效应。钙蛋白酶是Ca2+信号的特异性受体，位于骨骼肌细胞质中，通常以非活性形式存在，主要受Ca2+和内源性抑制因子钙蛋白酶抑制蛋白的调控。钙蛋白酶在肌节Z线中浓度最高，当细胞环境中的Ca2+水平增高时，可激活钙蛋白酶，使Z线发生特异性局部降解，破坏肌节，释放出肌丝，粗、细肌丝被胞质蛋白酶或溶酶体系统进一步降解，导致残留的肌原纤维的收缩力量减弱[11]。由此认为，在肌肉萎缩过程中，肌原纤维蛋白的降解至少需要协同两个及以上蛋白水解系统，钙蛋白酶可作为泛素-蛋白酶体系统的上游而发挥作用。Supinski等[25]发现，在C2C12细胞系炎症模型和小鼠盲肠结扎穿孔模型中，炎症细胞因子可诱导钙依赖磷脂酶A2活化，激活钙蛋白酶水解系统，增强线粒体自由基生成，致使细胞活力降低，小鼠膈肌功能障碍。同时，Supinski等[26]证实，牛磺酸可促进钙吸收，预防脓毒症引起的骨骼肌功能障碍。而Qiu等[27]发现，钙通道拮抗剂丹曲林对脓毒症引起的膈肌功能障碍具有保护作用，这与丹曲林下调高迁移率族蛋白B1、抑制钙蛋白酶-caspase-3蛋白水解途径有关。

caspase途径是凋亡细胞的主要降解途径，通常以酶原形式存在于正常细胞中，在凋亡程序启动后被激活。目前认为，caspase与脓毒症机体失控性炎症反应显著相关，在淋巴器官和组织凋亡中扮演重要角色[28]。有学者提出，脓毒症通过两步诱导肌肉蛋白加速分解：①通过钙蛋白酶和(或)caspases裂解肌原纤维蛋白；②通过泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体途径进一步降解[29]。研究发现，与野生型小鼠相比，caspase-3敲除小鼠的失用性肌肉萎缩程度显著减轻，同时肌细胞凋亡和炎症水平显著降低，证明caspase-3在失用性肌萎缩中发挥重要作用[30]。

2 蛋白质合成

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)是胞内重要的信号转导分子，可活化多个下游信号蛋白，其中蛋白激酶B(protein kinases B，PKB/Akt)是PI3K下游的主要效应物。研究表明，PI3K/Akt主要通过mTORC1信号通路激活蛋白质合成[31-32]。mTOR是细胞内的主要生长调节因子，以两种多蛋白复合体存在，其中mTORC1可磷酸化下游效应蛋白p70核糖体蛋白S6激酶和真核翻译起始因子4E结合蛋白1，调控核糖体蛋白S6和真核翻译起始因子4E活性，促进信使RNA翻译[33]。Shi等[32]研究发现，在脓毒症大鼠萎缩的腓肠肌中AMPK高度磷酸化，显著抑制了mTOR/核糖体蛋白S6激酶合成通路。Wu等[34]发现，盲肠结扎穿孔建模3 d后，膈肌PI3K/Akt信号活化受到抑制，给予SD大鼠尾静脉注射重组人神经调节蛋白-1β可通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路减轻膈肌萎缩，缓解膈肌收缩功能障碍。

脓毒症患者机体蛋白质合成总体水平降低，除蛋白合成途径被抑制外，转录因子调节也是重要原因之一。FoxO转录因子活性受翻译后修饰的调控，包括磷酸化、乙酰化和泛素化，而胰岛素样生长因子1等介导的PI3K/Akt信号通路可诱导FoxO磷酸化，使其由胞核转运至胞质，下调MuRF1、MAFbx以及自噬相关基因的转录和表达[35-36]。过表达FoxO3的小鼠肌肉质量显著减少[37]；与野生型小鼠相比，特异性过表达FoxO1基因的小鼠骨骼肌质量降低，Ⅰ型肌肉结构蛋白相关基因表达减少，表明FoxO1负调控骨骼肌质量和肌纤维基因表达，骨骼肌功能受损[38]。

3 激素调节

内分泌环境失调是肌肉萎缩、蛋白质水解以及抑制肌肉再生的主要原因。多种激素参与调控骨骼肌蛋白质合成-分解代谢和糖代谢以及损伤后肌肉质量的维持和修复。生长激素、胰岛素样生长因子1、甲状腺素、糖皮质激素等对骨骼肌的生长和功能均有重要作用。其中，胰岛素样生长因子1是维持骨骼肌质量的主要刺激因子，可使具有酪氨酸激酶活性的四聚跨膜受体底物的酪氨酸残基磷酸化，进而通过Akt/mTOR和Akt/FoxO途径促进蛋白质合成，抑制蛋白质降解[39]。另外，胰岛素样生长因子1和同型机械生长因子还可促进骨骼肌细胞增殖。脓毒症时，在炎症因子、脂源性因子、胰岛素拮抗激素等因素的影响下，机体产生严重胰岛素抵抗，一方面可抑制细胞内胰岛素信号转导，另一方面减弱骨骼肌细胞等胰岛素敏感组织对胰岛素调节的正常生理反应[40]。在临床诊疗过程中，Hermans等[41]发现，与传统治疗方法相比，对危重症肌病或长时间行机械通气的患者行强化胰岛素治疗可显著降低肌无力的发生率。

另外，Costelli和Baccino[42]证明，脓毒症机体高分解代谢状态与循环糖皮质激素水平升高密切相关。脓毒症时，糖皮质激素受体的表达和活性显著增加，使用糖皮质激素受体拮抗剂RU38486可预防肌肉萎缩，这与在炎症性疾病中使用高剂量糖皮质激素持续性治疗导致的肌肉萎缩现象一致[43]。糖皮质激素受体是一种Ⅰ型核激素受体，定位于胞质，与相应配体结合后，糖皮质激素受体转移到细胞核中，与糖皮质激素反应元素的特定DNA序列相互作用，介导基因转录[39]。Braun等[44]发现，与对照小鼠相比，糖皮质激素受体特异性敲除型小鼠更能抵抗脓毒症引起的骨骼肌萎缩。这些结论表明，糖皮质激素是炎症性肌肉萎缩的影响因素。

糖皮质激素还可刺激快肌纤维中肌生成抑制素myostatin(骨骼肌发育的负调节因子)的生成，诱导骨骼肌萎缩[39]。对糖皮质激素调控脓毒症骨骼肌萎缩机制的进一步研究发现，糖皮质激素主要通过糖皮质激素受体二聚化、核定位和转录激活而发挥作用[44]。高水平糖皮质激素可降低萎缩性肌病患者肌肉中胰岛素样生长因子1的局部生成，并抑制蛋白合成氨基酸信号通路[39]。与野生型小鼠相比，MuRF-1敲除型小鼠可抵抗地塞米松诱导的肌肉萎缩，维持骨骼肌质量和收缩性能[45]。此外，糖皮质激素还可激活钙蛋白酶系统，促进肌原纤维骨架蛋白水解[46]。以上结论表明，糖皮质激素是调节肌肉萎缩的重要因子。

4 炎症介质与氧化应激

脓毒症时，机体失控性炎症反应(尤其是循环高肿瘤坏死因子-α水平)被证实是机体蛋白损失的关键驱动因素[47]。研究表明，机体蛋白损失与核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路有关，NF-κB通过上调MuRF-1和MAFbx信使RNA的表达，激活机体泛素-蛋白酶体系统，导致蛋白质降解水平显著升高[47-48]。NF-κB家族由p50、p52、REL(cREL)、REL-A(p65)和REL-B组成，蛋白质形成同源或异源二聚体后成为具有功能的NF-κB，可转位至胞核内与DNA相结合，诱导靶基因转录[47]。特异性敲除IκB激酶β可缓解小鼠肌肉萎缩，表明NF-κB催化亚基IκB激酶β在肌萎缩中发挥重要作用[49]。除肿瘤坏死因子-α外，白细胞介素(interleukin，IL)-6在细胞分化、蛋白损失中也扮演重要角色。骨骼肌可局部产生IL-6，并根据不同的生理病理刺激而系统释放，IL-6自分泌可促进肌源性分化；在失控性炎症反应中，IL-6水平升高可促进肌肉萎缩[47]。Pelosi等[50]发现，IL-6可通过p90核糖体蛋白S6激酶/真核生物翻译延长因子2和mTOR/p70核糖体蛋白S6激酶通路抑制C2C12细胞系肌源性分化，其中，p90核糖体蛋白S6激酶可独立于mTOR/p70核糖体蛋白S6激酶通路，磷酸化下游真核细胞延伸因子2激酶，使其失活；真核细胞延伸因子2激酶可催化其唯一底物真核细胞延伸因子2苏氨酸56位点，使其磷酸化，降低与核糖体结合的能力，抑制肽链延伸。此外，IL-6水平升高与多发性肌炎、皮肌炎等疾病的严重程度呈显著正相关[47]。以上结论表明，炎症介质(如肿瘤坏死因子-α、IL-6)在肌肉萎缩中起重要作用。

线粒体超微结构异常、电子呼吸传递链功能障碍被认为是脓毒症肌肉萎缩的基础[51-53]。线粒体是细胞能量代谢的重要场所，呼吸链产生的超氧阴离子是活性氧类的主要成分，也是活性氧类的最主要来源，而脓毒症机体内源性活性氧类的产生同样可增强NF-κB活性，导致肌肉萎缩[47,52]。Odeh等[54]发现，与对照小鼠相比，p38α突变型小鼠肌肉组织中氧化应激信号及泛素化蛋白水平均显著降低，证明了p38α促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)可促进骨骼肌萎缩。MAPK是高度保守的蛋白激酶家族，其中p38是控制炎症反应最重要的成员。在小鼠盲肠结扎穿孔建模前预注射非瑟酮，可通过抑制p38 MAPK磷酸化，降低机体IL-1、IL-6和肿瘤坏死因子-α水平[55]。此外，研究证明，抑制p38 MAPK活性还可下调MuRF-1和MAFbx表达，预防肌纤维萎缩[48]。

5 其 他

Jiao等[56]研究证明，脓毒症大鼠膈肌功能障碍与内质网应激增加有关，并认为在内质网应激过程中，内质网功能受损和Ca2+流量失调是导致肌肉功能障碍的原因之一。有研究发现，在去神经支配、癌症恶病质、糖尿病、肾衰竭引起的肌肉萎缩模型中，啮齿动物肌肉过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)信使RNA水平降低[57-60]。PGC-1α在维持骨骼肌肉功能中发挥重要作用。PGC-1α通过抑制FoxO3与MAFbx启动子的结合而抑制依赖FoxO3的骨骼肌萎缩转录通路，与对照小鼠相比，过表达PGC-1α的转基因小鼠肌肉纤维萎缩程度降低[61]。此外，炎症因子风暴是脓毒症初始阶段死亡的主要原因之一，激活PGC-1α可降低机体IL-6水平，保护线粒体功能[54]。苯扎贝特是一种过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂，可增加PGC-1α的表达，对试验性脓毒症具有抗炎作用[62]。然而，苯扎贝特对脓毒症的保护作用目前尚不明确。

6 小 结

脓毒症机体氧化应激、炎症介质、内分泌激素水平改变等均参与蛋白质代谢的调节。一方面由于蛋白质合成信号减弱、RNA转录水平调控等导致蛋白质合成减少；另一方面，机体应激状态可通过钙蛋白酶、caspase、泛素蛋白酶体途径以及自噬溶酶体途径等导致蛋白降解水平增加。在诸多因素影响下，脓毒症时蛋白质处于高分解代谢状态，导致骨骼肌肌肉质量损失。此外，氧化应激、内质网应激、线粒体DNA损伤、线粒体电子呼吸链受损等也可导致骨骼肌功能障碍。PGC-1α是新的蛋白质代谢调节因子，深入研究其在蛋白质代谢中的作用机制，可为临床治疗脓毒症肌病提供新思路。