代谢组学在癫痫相关研究中的应用现状

龚雪，周东，洪桢

(四川大学华西医院神经内科，成都610041)

癫痫的发病由多因素共同参与，导致癫痫发作的关键性因素目前尚不明确，因此癫痫发作是一种不可控制、不可预测的状况［1］。尽管目前已有20多种抗癫痫药物应用于临床，但仍有约1/3的癫痫患者对药物治疗无效［2］。抗癫痫药物治疗效果不佳的原因可能是个体之间在药物代谢学、药效学、病理生理学基础方面存在较大差异［3］。另外，在抗癫痫药物的使用过程中还可发生多种严重、不可逆的不良反应［4］。因此，寻找新的特异性生物标志物迫在眉睫。而确定致痫靶点可有助于新药的研发，增加患者服药的依从性，同时减少药物不良反应。代谢组学是一种高通量、高灵敏度的检测技术，主要针对体液、组织、细胞等生物体中分子量＜1 000的小分子代谢物质进行分析［5－6］。代谢组学的变化可以直接或间接反映外界刺激或遗传修饰对生物体代谢应答的改变，因此代谢组学研究可以将遗传、环境和生理因素与特定的病理状态联系起来［6－7］。目前代谢组学检测技术已成为研究多种疾病潜在病理生理机制的重要手段［7－9］。癫痫发作后机体组织及循环系统内的微小变化均可反映在代谢物质水平上，因此代谢组学检测技术也可用于癫痫的研究。现就代谢组学在癫痫相关研究中的应用现状予以综述。

1 代谢组学研究概述

目前，核磁共振和质谱是代谢组学研究的两种主要分析平台。核磁共振通常用于鉴定组织代谢物，其具有样品制备简单(无需对样品提取、衍生化、分离且对样本无创)、分析时间短、信号稳定、可对代谢物进行绝对定量等优点，但灵敏度较低，无法检测出低丰度的代谢物质，导致检测覆盖范围局限［10］。同时，仪器成本昂贵限制了核磁共振的广泛应用［7］。

气相色谱－质谱法具有高分离能力、标准谱图库对比以及低仪器成本等优点［11－13］，在代谢组学研究中被广泛应用。气相色谱－质谱法检测的代谢产物主要与三羧酸循环、糖酵解、尿素循环、氨基酸代谢、脂肪酸代谢等途径相关。近年来，基于气相色谱－质谱法的快速、高灵敏度的检测方法被用于短链和中链脂肪酸的定量检测，是研究肠道微生物群落参与代谢途径的有效工具［14］;同时，也被用于研究神经递质［15］、激素和嘌呤代谢［16］失衡在不同神经系统疾病中的潜在作用。液相色谱－质谱法也是代谢组学研究中广泛应用的分析平台，其与气相色谱－质谱法互为补充，可增加复杂生物样品代谢物质的检测信息［17］。例如，二维液相色谱－质谱法可在一次操作过程中同时分析代谢组和脂质组，这是一种对有限的生物样本量进行大规模代谢组学研究的有效检测工具［18］。

非靶向和靶向性分析是代谢组学研究的两种主要策略［19］。非靶向代谢组学具有较好的代谢物检测覆盖率，但对低丰度代谢物质的检测重现性较差，且灵敏度低，同时需要对样品进行分离，因此对样品具有破坏性［20］。而靶向代谢组学具有灵敏度高、动态检测范围广以及定量结果准确率高等特点，被视为代谢物定量分析的金标准［21］。

虽然以上技术均能同时定量样本中共存的多种代谢物，但仍不能覆盖整个代谢组，只有多个分析平台联合应用，才能提高代谢组学研究的覆盖率。

2 代谢组学在人类癫痫相关研究中的应用

近年来，关于代谢组学与神经系统疾病相关性的研究不断发展。代谢途径的异常可能参与多种神经及精神疾病的发生，包括帕金森病［22］、阿尔茨海默病［23］、多发性硬化［24］以及脑卒中［9，25］等。目前的癫痫动物模型及癫痫患者与代谢组学的相关研究表明，在癫痫发作时多种代谢产物及代谢途径发生紊乱［26－27］，但人类代谢组学研究受遗传变异及其他混杂因素的影响较大，如药物、饮食和共病等。大部分代谢组学与癫痫的相关研究是基于对患者脑脊液、脑组织、血液、尿液、粪便样本进行分析。靶向研究的方法主要用于检测研究人员感兴趣的代谢物，如类固醇类激素、支链氨基酸、儿茶酚胺、嘌呤和尿酸盐等，而非靶向代谢组学则广泛应用于癫痫的研究，用于识别新的生物标志物。

2.1 人类脑脊液代谢组学 脑脊液代谢成分异常可直接反映脑部的病理生理变化，因此脑脊液成为神经病理学研究的首选生物样本。目前发现神经细胞膜离子通道(如编码钠离子通道α亚基［28］、编码电压门控钾通道亚基Kv7.2［29］基因突变)、神经递质及其受体(如γ－氨基丁酸A受体β亚基［30］和胆碱能受体烟碱α2亚基［31］)以及线粒体(如线粒体精氨酰转运RNA合成酶2［32］)功能紊乱均参与癫痫的发病;另外，过量的兴奋性氨基酸(如谷氨酸)积聚在细胞外，导致大量的钙离子通过N－甲基－D－天冬氨酸受体通道进入细胞内，继而诱发癫痫［33］。上述研究为测定脑脊液中与能量代谢相关的代谢物(或神经递质)并发现可靠的生物标志物提供了重要依据。

Bainbridge等［34］证明，SLC13A5(sodium－citrate cotransporter)基因突变的癫痫患者脑脊液与血液中代谢物质的重叠度相对较高，研究者使用非靶向质谱检测方法对SLC13A5基因突变癫痫患者的脑脊液代谢产物进行分析后发现，柠檬酸盐丰度显著升高且柠檬酸循环途径的中间产物失调，如丙二酸盐、乌头酸、柠檬酸二甲酯、异柠檬酸盐丰度显著增加，而3－羟基丁酸酯、磷酸胆碱、琥珀酰亚胺水平显著降低，此结果进一步支持了SLC13A5基因功能丧失可改变三羧酸循环代谢通路，使大脑代谢过程发生紊乱进而诱发癫痫的假设。Akiyama等［35］应用气相色谱－质谱法分析法发现，0～5岁癫痫患儿脑脊液中的2－酮戊二酸水平显著降低，同时吡哆胺和酪氨酸丰度显著升高;6～17岁癫痫患者脑脊液中的1，5－脱水葡萄糖醇丰度显著降低。由此推测，能量代谢降低和维生素B6代谢异常可能是小儿癫痫发生的潜在致病因素。2017年国际抗癫痫联盟共识指南提出了“免疫性癫痫”这一概念［36］，而近年研究发现，自身免疫性癫痫患者脑脊液中存在特殊的代谢网络，且与健康对照者之间的主要差异在于酮体的合成与降解，因此认为酮体代谢过程中产生的乙酰乙酸和乙酰胺可作为自身免疫性癫痫的潜在诊断标志物;另外，谷氨酰胺水平升高与疾病状态下氨基酸代谢紊乱有一定关系，提示癫痫发时脑脊液中的蛋白质、核酸合成减少;而且谷氨酰胺在谷氨酸－谷氨酰胺循环的递质传递中起重要作用，其含量改变会影响神经系统的兴奋性，这也是癫痫的发病机制之一［37］。

2.2 人类血清代谢组学 在临床工作中，由于血浆/血清的生物样本较脑脊液更易获取，针对癫痫与血清代谢组学相关性的研究较多［27，34，38－40］。癫痫患者与健康人群血清/血浆中的差异代谢物可分为氨基酸、脂肪酸、酰基肌醇、脂质、嘌呤、有机酸以及糖类物质等，而上述物质是支链氨基酸代谢、色氨酸代谢、脂质代谢、能量代谢、嘌呤代谢以及氧化应激/氧化还原等代谢途径中的重要代谢产物。研究证实，癫痫患者血清/血浆中的谷氨酸和乳酸丰度均显著上调，柠檬酸丰度则显著下调［27，38－39］。乳酸在许多生化反应过程中起重要作用，特别是在丙酮酸代谢过程中。γ－氨基丁酸的减少和谷氨酸的增加在癫痫发病中也具有重要作用。Wang等［27］证实，血清乳酸、甘油醛和反式－13－十八碳烯酸联合诊断48 h内痫性发作的准确率高达92.9%。除研究癫痫与健康人群血清代谢物质的差异外，还有研究对不同临床表现的癫痫患者进行亚组分析。Al Zweiri等［40］收集癫痫患者药物治疗前的血清样本，并应用核磁共振联合质谱法进行分析，结果发现，未进行药物治疗的癫痫患者血清样本中不包含可预测抗癫痫药物疗效的生物标志物。然而，一项根据血清代谢组学分析的研究结果表明，药物难治性、药物敏感性癫痫患者以及健康者血清中的代谢物质显著不同，其中药物难治性癫痫患者血清中3－羟基丁酸盐、2－羟基戊酸盐、2－羟基丁酸盐、乙酰乙酸盐、丙酮、乙酸盐、胆碱、丙氨酸、谷氨酸盐、乳酸等物质的水平显著升高，而葡萄糖、柠檬酸盐的水平则显著降低［38］。因此，血清代谢组学可作为优化患者治疗方案和提高患者生活质量的重要工具。

2.3 人类尿液及粪便代谢组学 由于尿液样本的易得性和无创性，其成为临床分析生物标志物的理想样品来源。有研究表明，SLC13A5突变型癫痫患者尿液中的丙酮酸代谢失调［34］，而丙酮酸具有保护细胞及组织的功能［41－42］，可为细胞提供能量，调节体内糖代谢紊乱，具有抑制糖基化反应、抗氧化应激等作用［42］。另外，丙酮酸盐水平降低通常也提示患者能量代谢增强［41］。另有研究发现，2－哌啶－6羧酸盐、6－氧阿片酸盐和哌啶酸盐是醛脱氢酶7A1突变型癫痫的潜在诊断生物标志物［43］。因此，为了更好地了解癫痫患者尿液样本中总体代谢物质及代谢途径的改变，需要更多大样本相关研究进行验证。

另外，肠道微生物群在多种神经系统疾病(包括癫痫)的发生中起重要作用。粪便代谢组学研究可以提供宿主、饮食以及肠道微生物间相互作用的代谢信息，为探索微生物群代谢与宿主代谢之间的联系提供了新途径。目前粪便代谢组学已广泛应用于多种疾病生物标志物的识别和功能注释的研究，包括肠易激综合征［44］、非酒精性脂肪肝［45］、心血管疾病［46］、糖尿病［47］、帕金森病［48］以及自闭症［49］等，但粪便代谢组学研究方法尚未应用于癫痫的研究。因此，未来亟待更多关于粪便代谢组学与癫痫相关性的研究，探索肠道微生物群通过改变代谢产物导致代谢途径异常，继而影响癫痫的病理生理机制。

2.4 人脑组织代谢组学 人类脑组织的代谢组学研究主要基于核磁共振技术，核磁共振技术可快速、准确地检测活体特定区域的生化成分，且最大限度地减少组织破坏。Detour等［50］发现，谷氨酰胺和谷氨酸是鉴别诊断海马硬化与非海马硬化癫痫患者的标志物，与海马硬化癫痫患者相比，非海马硬化癫痫患者的N－乙酰天冬氨酸及其相关代谢途径中关键代谢产物的水平更高，如磷脂代谢途径代谢产物(甘油磷酸胆碱、磷胆碱和总胆碱等)和某些特定氨基酸代谢途径产物(如抗坏血酸、牛磺酸和谷胱甘肽)。有学者发现，高频率的癫痫发作与醋酸、丙氨酸、肌酸、谷氨酰胺、牛磺酸、甘油磷酸胆碱以及缬氨酸水平升高相关［51］。使用高分辨魔角旋转核磁共振法可更灵敏地发现常规影像学检测手段无法发现的致痫灶，为患者手术提供精准定位、定性诊断。

3 代谢组学在癫痫动物模型中的相关研究

虽然目前已经建立了多种癫痫动物模型，但只有少数动物模型被用于代谢组学研究。主要的动物模型包括毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态小鼠模型、红藻氨酸大鼠模型以及遗传缺失癫痫大鼠模型，通过这些动物模型研究鉴定的代谢物质主要来源于脑组织(全脑或特定区域)，其能更好地反映病灶部位的病理生理变化。Fauvelle等［52］研究发现，遗传缺失癫痫大鼠模型脑组织中谷氨酸－谷氨酰胺－γ－氨基丁酸、牛磺酸－磷酸乙醇胺水平均显著降低，这也为研究牛磺酸和磷酸乙醇胺可能具有减少癫痫发作的作用提供了新的理论假设。通过对慢性期毛果芸香碱癫痫持续状态小鼠模型的代谢组学分析，发现海马中三羧酸循环途径中关键酶活性显著降低［53］，表明海马硬化癫痫患者的海马结构中可能存在三羧酸循环途径紊乱。

颞叶癫痫是一种常见的继发性癫痫，其特征是在脑损伤后存在自发性癫痫发作和无癫痫发作的潜伏期。有研究利用基于液相色谱－质谱法的脂质组学方法对颞叶癫痫小鼠模型的脑组织进行分析，结果发现脂质、嘌呤、固醇代谢以及大脑和血清中的维生素D3代谢产物可作为癫痫发生和预测致痫灶损伤严重程度的代谢生物标志物［54］。以上研究为颞叶癫痫的早期特异性诊断提供了可能，有助于因急性创伤所致慢性癫痫的靶向药物的研发。

4 代谢组学在抗癫痫药物中的研究

研究表明，生酮饮食和中链脂肪酸等可能通过改变能量及线粒体代谢、改变多不饱和脂肪酸的细胞氧化活性以及调节神经保护因子等机制发挥抗癫痫作用［55］。McDonald等［56］通过研究中链脂肪酸(三辛酸和三庚酸)喂养对小鼠海马结构中葡萄糖代谢和三羧酸循环代谢的影响，发现海马结构中的葡萄糖利用率显著降低，由此推测，中链三酰甘油可能通过纠正戊糖磷酸、糖酵解和三羧酸循环代谢途径紊乱而发挥抗癫痫的作用。

犬尿氨酸代谢途径是指将色氨酸氧化为烟酰胺，进而转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸［57］。犬尿氨酸被认为是参与中枢神经系统疾病发生、发展的多种途径的中间代谢产物，如参与谷氨酸和烟碱受体的调节、炎症反应以及氧化应激等［58］。Heischmann等［59］报道，生酮饮食可通过调节犬尿氨酸的代谢途径起到抗癫痫作用，这不仅为研究癫痫发病机制提供了潜在的生物标志物，还为治疗癫痫提供了新的治疗策略。

丙戊酸钠属于经典的抗癫痫药物，是临床常用的抗癫痫药物之一，具有广谱、价廉等优点。丙戊酸钠也可用于双向情感障碍等精神疾病的治疗［60］。然而，有数据表明，使用丙戊酸钠治疗的癫痫患者会出现多种不良反应［61］，尤其是对肝脏的毒性［62］。目前的生化指标如丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶等多反映肝脏组织损伤的晚期阶段，因此亟须更加灵敏、有效的标志物评估肝脏的早期损害。Huo等［63］通过对癫痫患者血清进行代谢组学研究，发现丙戊酸钠所致的异常肝功能与正常肝功能患者的血清代谢组有显著差异，且该研究发现了与丙戊酸钠致肝毒性相关的代谢标志物，如乳酸、乙酰乙酸、胆碱、肌酸、N－乙酰糖蛋白、丙酮酸以及尿酸等。Chen等［64］研究发现，丙戊酸钠诱导的肝毒性癫痫患儿血清中的脂肪酸水平、柠檬酸循环、尿素循环、氨基酸代谢以及胆汁酸途径均发生了改变。有研究应用丙戊酸钠诱导孕期第9.5天健康母鼠，结果发现，丙戊酸钠可能通过干扰胚胎中的嘌呤和嘧啶代谢产生致畸作用［65］，但丙戊酸钠的致畸作用机制目前尚不明确。

5 展 望

虽然代谢组学研究平台及方法取得了一定进展，但目前代谢组学在癫痫相关领域的研究仍处于探索阶段，且代谢组学数据库还需要进一步完善。因此，未来仍需通过更加严谨科学的研究方法排除多种混杂因素，获得可真正用于临床的转化医学成果。同时，还应联合多种分析平台及多部位生物样本进行代谢组学研究，获得全面的信息，以揭示代谢组学与癫痫发病的相关异常代谢通路。另外，微生物群失调和微生物代谢紊乱与癫痫的发病密切相关［25］。肠道中也存在参与脑功能调节的代谢物，且其浓度可由肠道微生物群进行调节，进而影响神经元的功能［66］。代谢组学与其他组学技术(如宏基因组学、蛋白质组学、转录组学)的联合应用可更好地揭示宿主与内源、外源因素相互作用的机制［67－68］，为癫痫潜在的发病机制、诊断、预后及有效治疗提供新的生物标志物。