高效液相色谱-质谱法同时测定养殖鱼肌肉中8种激素*

龙 举，吴彩妮，曾军杰，梅光明

(1 浙江省海洋水产研究所，水产品加工与质量安全研究室，浙江省海水增养殖重点实验室,浙江 舟山 316021；2 浙江伊渼源检测科技有限公司，浙江 舟山 316100)

激素是指由体内的某一细胞、腺体或者器官所产生的可以影响机体内其他细胞活动的化学物质[1]。由于激素化合物能提高饲料转化率，缩短动物生长周期，促进动物生长繁殖等作用近年来被广泛用于水产养殖[2]，被用以提高养殖鱼的经济效益。激素在养殖鱼中违规使用，造成了严重的安全隐患。激素随着食用养殖鱼肉进入人体会干扰机体激素平衡，导致性早熟，机体中水、电解质、蛋白质、脂肪和糖的代谢紊乱，以及提高乳腺癌、前列腺癌等发病率，对健康具有潜在的危害[3]，会影响人体生理活动[4]。欧盟规定在饲料中禁止使用雄激素[5]，中国明确规定了部分激素在动物性源性食品中的最大残留量[6]。

目前检测激素类残留的方法主要有酶联免疫法[7]、高效液相色谱法[8-9]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[10-11]和液相色谱-串联质谱法 (LC-MS /MS)[12]。结合方法稳定性、灵敏度、工作效率等因素，选用LC- MS /MS 作为本实验检测方法，建立了同时测定养殖鱼肌肉中酚类、天然生成及人工合成雌激素以及环境激素的新方法，该方法前处理方法简单、灵敏度高、稳定性好，能快速高效的检测养殖鱼肌肉中多种激素的残留，同时也为其他动物源性食品中的兽药多残留分析提供参考。

1 实 验

1.1 材料与试剂

水产样品共120个，随机在浙江省内宁波、温州、杭州、舟山等地市场及养殖场购买。

试剂：标准品包括诺龙、群伯龙、甲基睾酮、己烷雌酚、己二烯雌酚、双酚A、雌二醇 (纯度98.5%～99.0%) 德国Dr公司；马拉硫磷购自国家海洋环境监测中心；氯化钠(分析纯)，阿拉丁试剂公司；乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯)Sigma公司；试验用水为Milli-Q超纯水。

标准溶液配制：分别取8种激素标准品用甲醇配制成100.0 μg/mL的标准储备液；临用时用甲醇配制成1 μg/mL的混合标准液，现用现配。用流动相将混合标准溶液稀释成一系列浓度是标准溶液，待测。

1.2 仪器与设备

仪器：Waters Acquity 超高效液相色谱仪-高分辨-四级杆-飞行时间质谱仪(Waters Xevo G2-S QTof-MS)、AcquityTM型超高效液相色谱仪(UPLC)、Quattro Premier XE串联四极杆质谱仪，美国Waters公司；涡旋振荡器(IKAM S1)，德国IKA公司；Eppendorf Centrifuge 5810高速离心机，德国Eppendorf公司；N-EVAP-45氮吹仪，美国Organomation公司；AL204型电子天平，瑞士梅特勒-托利多仪器公司。

1.3 样品前处理

准确称取2.00 g(±0.01)样品于50 mL离心管中，加入 0.7 g氯化钠，再加5 mL乙腈，涡旋混匀，40℃超声提取10 min后，在4 ℃下7000 r/min离心5 min，取上清液转移至15 mL聚四氟乙烯离心管中。再用5 mL乙腈重复提取一次，合并后的上清液45 ℃氮气吹干。加入1 mL 5 mmol乙酸铵水溶液-乙腈(90:10)复溶残渣，加50 mg PSA，涡旋1.0 min，在4 ℃下7000 r/min离心5 min，取上清液经0.22 μm有机滤膜过滤后上机测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm， 1.7 μm)； 柱温40 ℃；样品温度25 ℃；进样量5 μL；流速0.3 mL/min；流动相A为5 mmol乙酸铵水溶液，B为乙腈，梯度洗脱设置见表1。

表1 8种激素梯度洗脱表Table 1 8 hormone gradient elution tables

1.5 质谱条件

离子源: 电喷雾正负离子源；扫描模式为Full Scan/MSE；检测方式: 多反应监测(MRM)；毛细管电压为3.0 kV；锥孔电压为35 V; 离子源温度为120 ℃；脱溶剂气温度为380 ℃；锥孔反吹气为高纯氮气，流速为50 L/h；脱溶剂气为高纯氮气，流速为600 L/h；运行时间为15 min。Source Acquisition Mode、Da Range及Collision Energy根据不同激素的特性选择调试合适的条件，低碰撞为0V，高碰撞能为20～30 V；质量扫描范围为100～1000 Da；采用2.0 μg/L亮氨酸脑啡肽(分子量为556.2771/554.2615(+/-))进行实时校准以保证目标物的质量数精度。锥孔电压和碰撞能量等质谱多反应监测实验条件如表2所示。

表2 8 种激素质谱多反应监测实验条件Table 2 8 hormones mass spectrometry multiple reaction monitoring experimental conditions

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

实验选择乙腈作为提取试剂，比较了震荡超声提取及振荡提取对养殖鱼肌肉中8种激素的提取效果。如图1所示，取同一草鱼阴性样本两组，均加入100 μL 100 ng/mL的混合标准溶液，分别采用震荡超声提取及振荡提取，经试验震荡超声提取时，己二烯雌酚回收率最低为70.2%，诺龙回收率最高为98.5%；振荡提取时己群勃龙回收率最低为66.4%，马拉硫磷回收率最高为86.2%，振荡提取效果明显不及震荡超声提取。

由图1可知震荡加超声提取方式的提取效果优于振荡提取。这是由于样品基质含蛋白质以及水分含量高，成分复杂且分散，振荡提取易使其粘壁对目标物造成损失。超声提取利用机械效应和空化效应，来增加大分子运动速度以及频率，从而提高介质的穿透力达到对目标物进行高效提取。

图1 两种不同提取方式的回收率Fig.1 Recovery of two different extraction methods

2.2 质谱条件的优化

采用注射泵连续进样对8种激素进行分析，诺龙、群伯龙、马拉硫磷、甲基睾酮采用ESI+模式，己烷雌酚、己二烯雌酚、双酚A、雌二醇采用ESI-模式，对标准溶液分别进行一级质谱全扫描，得到每种激素的分子离子，对锥孔电压及毛细管电压进行优化，确定准分子离子峰。通过子离子扫描，并对碰撞能量进行优化，确定8种激素的定量及定性离子。

2.3 色谱条件的优化

采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 (50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，分别选择乙腈-水、甲醇-水作为流动相同时分析8种激素的分离效果。实验表明，乙腈-0.1%甲酸水可使诺龙、群伯龙、马拉硫磷、甲基睾酮等4种激素(EIS+)出峰分离，且峰形良好，但不能使4种激素(EIS-)完全出峰。使用5 mmol乙酸铵水溶液-乙腈为流动相可使己烷雌酚、己二烯雌酚、双酚A、雌二醇等4种激素出峰分离，峰形较好，且其他4种激素目标峰无明显变化。故本实验选择5 mmol乙酸铵水溶液-乙腈为流动相分析8种激素，如图2为各激素标准溶液的MRM色谱图。

图2 8种激素标准溶液的MRM色谱图Fig.2 MRM chromatogram of 8 hormone standard solutions

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系、检出限及定量限

用甲醇将8种激素标准使用稀释成质量浓度为1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/L混合标准工作溶液，以外标法获取标准曲线。进样后，以目标物的峰面积(y)对应的质量浓度(x)分别绘制标准曲线，计算其相关系数。方法在2.0～100 μg/kg范围内8种激素线性良好，相关系数r2均大于0.99。分别以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比确定方法检出限(LOD)及定量限(LOQ)，检出限范围为0.3～0.5 μg /kg，定量限范围为0.9～1.5 μg /kg，具体结果详见表3。

表3 8种激素的线性方程、LOD和LOQTable 3 Linear equations, LOD and LOQ of 8 hormones

2.4.2 回收率及精密度

通过配制基质工作溶液来消除基质效应的影响。分别采用空白草鱼、大黄鱼样品制作基质提取液和加标回收实验，根据目标药物在质谱中响应的强弱加入不同浓度的混合标准系列，得到每种物质的线性范围及相关系数。每个加标浓度平行测定6次，按本方法进行检测，得到回收率为70.2%～86.2%，相对标准偏差(RSD)为3.56%～8.58%。大黄鱼中8种激素的方法学实验结果见表4。

表4 8种激素的线性范围、回收率、相对标准偏差Table 4 Linear range, recovery, RSDs of 8 hormones

2.4.3 实际样品检测

表5 养殖鱼肌肉中激素类检出情况表Table 5 Table of hormone detection in Farmed fish muscle

用此方法对浙江省不同地域、季节和品种的养殖鱼肌肉中激素类药物开展了筛查和定量检测工作。共计采集和筛查养殖鱼样品120个，包括鳙鱼、多宝鱼、石斑鱼、大黄鱼、乌鳢、草鱼、鲈鱼、黄鳝、鲤鱼、黄颡鱼、乌鳢、黑鲷共12种。样品均取肌肉可食部位，匀浆后冷冻保存。在120个样品中共筛查出2例样品共2种激素，经确证和UPLC-MS/MS定量检测后确定为2个激素参数有检出样品。养殖鱼肌肉中激素类检出情况见表5。

3 结 论

建立了高效液相色谱-串联质谱法同时测定养殖鱼肌肉中8种激素的检测方法，并优化了前处理方法及色谱、质谱条件，整体实验操作简便、耗时短，此方法灵敏度高、稳定性好，能快速高效的定性筛查和定量分析大批量样品中的多种激素类药物，也为保障养殖鱼类水产品质量安全提供技术支持。