免疫和炎症中的自噬

耿聪聪，谷变利，孔金玉，张秀森，王立东，王云龙，郭永军,李恩民，赵远锦，高社干

自噬是真核细胞处理过大而不能被蛋白酶体降解的胞内细胞器和蛋白质聚集物的唯一已知机制。因此，这一机制被称为自噬的溶酶体降解途径，也被用来降解入侵细胞内的微生物(如病毒、细菌和原生动物)[1-2]。在多细胞生物中，自噬途径或自噬蛋白的独特功能在控制免疫的其他不同方面也起着核心作用，这种作用也许不那么明显，但从目的性上来说是很直观的。

自噬机制与大多数细胞应激反应途径相连接，包括那些参与控制免疫反应和炎症的途径[3]。不仅在自噬途径的水平上，而且在自噬蛋白和免疫信号分子之间也有直接的相互作用[4]。自噬途径/蛋白与免疫和炎症之间存在复杂的相互作用关系，自噬蛋白在诱导和抑制免疫和炎症反应中起作用，免疫和炎症信号在诱导和抑制自噬中起作用。此外，与癌症、神经退行性疾病和年龄增长相似[5]，自噬缺陷通过自噬基因突变和/或微生物拮抗可能是许多传染病和炎症综合征发病的基础。

本文综述了对自噬、免疫和炎症三者之间的不同交叉反应的最新研究进展，并对自噬在食管相关疾病中的作用进行了阐述。

1 自噬的机制和膜动力学

自噬是细胞质物质(包括可溶性大分子和细胞器)被运送到溶酶体进行降解的途径的总称[6]。至少有3种不同类型的自噬，包括巨型自噬、伴侣介导的自噬和微型自噬。巨型自噬，通常简称为自噬，是本综述的主题。在这个途径中，细胞质的一部分(直径通常为0.5～1 μm)被一个隔离膜或“噬菌体”吞噬，形成一个被称为自噬小体的双层膜结构。自噬小体的外膜与溶酶体融合形成自噬溶酶体，导致溶酶体酶对自噬小体内容物的降解。自噬小体形成需要ULK1蛋白激酶复合体、Beclin-1-Vps34激酶复合体和两个泛素样结合系统，其中一个系统由自噬相关基因5( autophagy related gene 5,ATG5)和自噬相关基因12(autophagy related gene 12,ATG12)形成，另一个系统由微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1 light chain 3,LC3)形成。自噬小体也可以与核内体或多囊泡小体和主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅱ类负载室融合[7]。随着更多的自噬小体和溶酶体融合，自噬溶酶体变得更大，但在终止期，溶酶体被管状和碎片化以进行更新[8]。

自噬小体形成的膜动力学涉及复杂的过程，目前还不完全清楚。但最近的一些研究表明，内质网(endoplasmic reticulum,ER)对自噬小体的形成至关重要。内质网池通常与自噬小体的发育有关，电子断层扫描分析表明内质网和自噬体膜之间有直接联系[9-10]。

除了内质网外，其他膜也可能参与自噬小体的形成。ATG9是另一种多跨膜蛋白，在自噬以及反式高尔基网络、核内体和自噬体前体之间的运输中起着至关重要的作用[11-12]。研究表明，线粒体、质膜和核膜也可能是自噬小体膜的来源[13-15]。然而，缺乏对自噬体膜上这些结构的特异性蛋白标记的检测，使得几十年来自噬体膜来源的问题没有得到解答。细胞可能在不同的环境中使用不同的膜源来形成自噬小体，从而允许膜动力学的专一化，以及不同的自噬诱导信号刺激捕获空间上不同的物质。

2 自噬与抗感染

在多细胞动物中，自噬途径和/或自噬蛋白在抵抗细菌、病毒和原生动物感染方面起着至关重要的作用。自噬基因的遗传缺失或敲除通过阻止植物固有免疫或超敏反应过程中程序性细胞死亡的失控扩散来保护植物免受病毒、真菌和细菌感染[16]。在其他生物中，自噬蛋白以细胞自主的方式控制细胞内病原体的感染。在果蝇中，自噬基因突变增加了对病毒(水泡性口炎病毒)和细菌(单核细胞增生性李斯特菌)感染的易感性[17-18]。在网柄菌属和秀丽隐杆线虫中，自噬基因突变增加了对致死性鼠伤寒沙门氏菌感染的易感性[19]。在小鼠中，巨噬细胞和中性粒细胞中ATG5的敲除增加了感染单核细胞增生性李斯特菌和原生动物弓形虫的易感性[20]，而神经元特异性的ATG5敲除增加了中枢神经系统辛德毕斯病毒感染的易感性[21]。在体外研究中，自噬途径和蛋白质也可能具有“前病毒”或“概率”效应；然而，到目前为止，这种效应在体内的证据还很缺乏。自噬基因介导体内感染抵抗的机制尚不完全清楚，但可能涉及异源吞噬、其他自噬蛋白对微生物复制或生存的依赖效应、先天和获得性免疫反应的激活和/或病原体诱导的细胞死亡的改变。

牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis,Pg)是慢性牙周病发生和发展的主要牙周病原体，并在2016年首次被证实与食管癌的临床病理学特征、患者5 a总生存有显著统计学关联[22]。Pg通过脂筏与早期吞噬小体结合，侵袭多种细胞，包括牙龈上皮细胞、颊上皮细胞和内皮细胞[23-25]。研究表明，自噬在防御Pg感染方面起着至关重要的作用。Pg脂多糖(porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,LPS)导致活性氧介导的自噬[26]，Pg的脂蛋白基因PG0717是Saos-2细胞系激活自噬所必需的[27]。Pg能激活LC3-I/LC3-II的转化，增加ATG5-ATG12的结合力和Beclin-1的表达，并以多种感染依赖方式增加自噬小体的形成和自噬溶酶体的形成[28]。Pg与自噬体结合，并通过延迟晚期自噬体与溶酶体的融合来破坏自噬。

3 微生物反击

当微生物发生应激反应时，需要制定阻止宿主防御机制的策略，此类策略的数量是宿主防御机制在免疫中重要性的替代措施。病毒和细胞内细菌已经进化出多种方式来适应宿主的自噬[1,29]。它们可以对抗自噬启动或自噬成熟，逃避自噬识别，或利用自噬途径的组成部分促进自身复制或细胞内生存。此外，微生物对自噬的拮抗作用不仅阻止了细胞内病原体的异源降解，还阻止了自噬在先天免疫和获得性免疫中的功能。

病毒阻断自噬的策略包括阻断自噬上游正调控因子，例如干扰素诱导的RNA激活的eIF2α蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)信号通路、激活自噬负调控因子(如营养感应TOR激酶信号通路)或直接拮抗自噬机制[29]。

细菌拥有多种策略来避免通过自噬溶酶体途径降解。许多存在于吞噬体或其他空泡区室中的细菌具有抑制溶酶体融合或成熟的方法，就分枝杆菌而言，可以通过刺激自噬的治疗方法来部分克服[1,30]。Pg也可以通过逃避自噬在胞内长期存活。LPS是Pg细菌表面的重要毒力因子之一。LPS的脂质A成分能够被人类多种细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)，如Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)所识别，二者的相互作用引起宿主细胞中炎症反应的产生。然而，一些内化于胞内的细菌在自噬途径中可抑制自噬体的成熟或延缓自噬体与溶酶体的融合，使细菌在胞内得以生存和增殖。胞内Pg的定位可能因宿主细胞类型不同而异，Pg可位于不同的细胞器，如细胞质、内体和自噬体中[31]。利用宿主自噬途径逃避固有免疫是Pg在宿主体内持续存在的一种独特策略。Lee等[32]证实了Pg利用富含内质网的自噬体成功地持续存在，并避开了抗微生物泛素—溶酶体降解途径。Pg通过Mfa1菌毛靶向DC-SIGN(树突状细胞特异性细胞间黏附分子3结合非整合素因子)的机制来破坏自噬从而在树突状细胞中存活[33]。

4 免疫信号分子对自噬的调控

大量调节自噬的免疫相关信号分子进一步强调了自噬在免疫中的重要性。一些研究表明[2-4,30]，自噬由不同家族的病原体识别受体(如TLR、NOD样受体和双链核糖核酸结合蛋白PKR)、DAMPS(如ATP、ROS和错误折叠蛋白)、病原体受体(如CD46)、干扰素-γ及其下游免疫相关的GTP酶、DAP激酶、JNK、CD40、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、NF-κB抑制剂(IKK)和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)等诱导。高迁移率族蛋白(high mobility group box,HMGB)也被证明既是天然免疫信号中核酸的通用感受器[34]，也是自噬的诱导者[35]。自噬被BCL2、NF-κB、TH2细胞因子和典型的营养敏感胰岛素-AKT-TOR途径所抑制。

在大多数情况下，免疫相关信号分子控制自噬的机制还不清楚。然而，有一些例子表明免疫信号和自噬蛋白之间的特定相互作用可能与这些机制有关。例如，beclin-1和BCL2(抑制其活性)之间的相互作用被认为是被TLR(toll-like receptors)衔接子髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response proteon 88,MyD88)和β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)以及HMGB1破坏的，它们与beclin-1结合并取代BCL2[3,33]。负责在细菌感染时诱导自噬的两个细胞内传感器NOD1和NOD2与自噬相关基因16L1(autophagy-related 16-like 1 genes,ATG16L1)相互作用，并将其募集到质膜，导致侵入性细菌(福氏志贺菌)与LC3的关联增强[35]。与克罗恩病相关的NOD2突变损害了ATG16L1质膜募集和细菌与LC3的共同定位[36]。

5 自噬与适应性免疫

自噬蛋白在适应性免疫中发挥作用，包括在免疫系统的发育和动态平衡以及抗原呈递中发挥作用。小鼠特定淋巴细胞群体中不同自噬基因的敲除已显示出自噬蛋白在维持B1a B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和胎儿造血干细胞的正常数量中起着至关重要的作用[2,37-38]。在T细胞中，线粒体数量在胸腺细胞向成熟循环T细胞的转变过程中受到发育调节，自噬缺陷细胞的发育缺陷可能与线粒体清除缺陷有关[37]。自噬在免疫系统的发育和动态平衡中的另一个关键功能是清除胸腺中的自体反应性T细胞[37]。胸腺上皮细胞中存在高水平的自噬，其中自噬参与了自身抗原向MHCⅡ类负荷室的运送。胸腺上皮细胞ATG5的基因破坏导致某些MHCⅡ类限制性T细胞特异性和自身免疫的选择改变[39]。

自噬蛋白可能参与抗原提呈的不同过程，包括向CD4+T细胞递送内源性MHCⅡ类抗原，促进抗原供体细胞向CD8+T细胞的交叉递呈，树突状细胞向CD4+T细胞递呈吞噬的抗原，以及MHCⅠ类抗原递呈给CD8+T细胞。

6 自噬蛋白对免疫信号的调节

自噬蛋白在固有免疫信号的激活和失活中发挥作用[4]。自噬途径通过将病毒核酸递送至内体Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)来激活浆细胞样树突状细胞中Ⅰ型干扰素的产生[40]。相比之下，自噬蛋白通过自噬消除受损的线粒体或减少活性氧[41]并通过ATG5-ATG12与RIG- I样受体(RIG-I-like receptors,RLR)信号分子的胱天氨酸募集结构域结合[42]，负调节RLR介导的Ⅰ型干扰素的产生。此外，自噬蛋白ATG9A，而不是ATG7，负向调节干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)的激活，而STING是激活Ⅰ型干扰素和刺激DNA产生促炎细胞因子所必需的[11]。因此，自噬蛋白似乎可以通过自噬依赖和非自噬两种机制负向调节干扰素的产生。

自噬通路和/或蛋白质在控制炎症信号中也起着至关重要的作用。一个主要作用是调节炎症的转录反应。自噬缺陷细胞中积累的衔接蛋白p62水平升高，通过涉及肿瘤坏死因子受体相关分子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6 ,TRAF6)寡聚的机制激活促炎转录因子NF-κB[43]。自噬蛋白在炎症信号传导中的第二个重要作用是在炎症小体水平。该复合体包含NOD样受体低温比林蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)和胱天氨酸酶1，并被细胞感染或其他应激激活，从而促进促炎细胞因子如白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的成熟[4]。

7 自噬与炎症性疾病

自噬蛋白依赖的免疫功能紊乱不仅可能增加感染的易感性，还可能导致慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病。自噬的异常亦有助于许多疾病中炎症的发生和发展。迄今为止，唯一明确的联系是自噬调节因子的突变和克罗恩病之间的联系。在其他疾病(胃食管反流病、Barrett食管)，自噬作用的直接证据是有限的[44]。在一项研究中，与来自Barrett食管患者的细胞系相比，正常食管鳞状上皮细胞和受胆管成分去氧胆酸刺激的鳞状细胞均表现出更高水平的Beclin-1表达[45]。虽然急性暴露于去氧胆酸可以诱导这些Barrett食管细胞系的Beclin-1表达和自噬，但在慢性暴露后这部分的水平下降。相比之下，其他研究人员分析了活检标本中自噬囊泡的形态学特征，发现尽管自噬水平相对于生长异常Barrett食管中的正常细胞普遍降低，但Barrett食管中的自噬水平与正常的鳞状黏膜相比增加[45]。

8 自噬与食管肿瘤

自噬发生在包括食管在内的大多数组织类型的基础水平[46-47]，并已被证明是在对各种应激源(包括饥饿、缺氧和炎症)的反应中诱导的。对于癌症来说，自噬的作用是复杂的。自噬在早期癌变中起抑癌作用。然而，在已发生的肿瘤中，自噬作为一种肿瘤促进因子，有助于瘤细胞在恶劣的肿瘤微环境中生存以及应对治疗相关的应激[48]。在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中诱导自噬囊泡形成的细胞因子中，有一个共同的聚集点是UNC-51样自噬激活激酶1(unc-51-like kinase 1,ULK1)。ULK1是一种对自噬囊泡形成必不可少的丝氨酸/苏氨酸激酶[49-50]，它通过调节几条上游信号通路来诱导食管癌相关自噬的发生。AMP活化蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)是一种自噬激活剂，通过直接磷酸化ULK1以及磷酸化与ULK相互作用的蛋白发挥作用[51]。AMPK/ULK1轴与肿瘤转移相关因子结肠癌转移相关-基因1(metastasis-associated in colon cancer-1,MACC1)诱导的自噬激活有关。在使用食管癌细胞系ECA9706和KYSE150进行的体外研究中，证明MACC1以一种依赖自噬的方式促进食管癌的增殖、迁移和侵袭[52]。自噬与Claudin 1d蛋白介导的这些ESCC细胞系的增殖、迁移和侵袭的增加有关，因为这些表型被一种可阻断自噬囊泡形成的Ⅲ类PI3激酶抑制剂3-甲基腺嘌呤取消。虽然Claudin 1蛋白的过表达也促进了原代正常食管上皮细胞中AMPK的激活，但没有观察到下游自噬的诱导。因此，Claudin 1蛋白在正常细胞中的功能可能与其在恶性细胞中的功能不同。

常用的化疗药物顺铂和5-氟尿嘧啶(5-fluouracil，5FU)在体外均能诱导ESCC和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)细胞的自噬[53-58]。在一项研究中，ESCC细胞系OE21和EAC细胞系OE33显示出对5FU和顺铂的敏感性，这与细胞凋亡和缺乏自噬诱导有关[53]。而对5FU和顺铂耐药的食管癌细胞株KYSE450和EAC细胞株OE19均可诱导自噬[57]。在KYSE450中，Beclin-1和ATG7的基因抑制共同减少了5FU处理后自噬囊泡的诱导，同时降低了细胞存活率，表明自噬参与了化疗耐药性的产生。在这项研究的后续研究中，发现对5FU敏感的OE21和OE33细胞系中的凋亡与泛素样蛋白修饰物干扰素刺激基因15(the ubiquitin-like protein modifier interferon-stimulated gene 15 ,IGS15)的上调有关，IGS15起到了阻断自噬的作用[59]。IGS15调节自噬的机制以及靶向IGS15在5FU治疗中的应用仍有待确定。

9 未来展望

证明自噬被用来攻击入侵细胞内细菌的第一系列研究发表于2004年[60]。虽然在几十年前就已经在细菌和病毒感染的细胞中观察到了自噬现象，但这一系列研究仍是一个开创性的进步。在过去的几年里，自噬领域的研究揭示了这组基因的复杂性和功能多样性，不仅可以保护多细胞生物免受感染的威胁，还能抵御宿主自身对感染的反应的威胁。最近的研究进展可能不仅修改了对免疫的认识，而且也重塑了对炎症疾病发病机制的理解。

许多研究证明，自噬是促成食管癌发病的一个因素，并支持进一步探索自噬调节剂作为工具，来提高对食管癌现有和实验疗法的反应。由于自噬在食管癌细胞中是一个动态过程，在环境依赖的方式下被调节，未来的研究界定自噬在健康和疾病条件下食管癌生物学中的作用，对于指导食管癌中靶向自噬的治疗策略至关重要。研制具有特异性和强效激活或抑制自噬能力的药物对于研究自噬在癌症生物学中的作用具有重要意义。