脑利钠肽基因启动子甲基化与风湿性心脏病继发肺动脉高压患病风险的相关性

朱才民，李旎，邵国丰

肺动脉高压（PAH）是一类以肺血管阻力进行性升高并伴随着肺血管重塑为特点的少见并且致命性的疾病，其病理生理特征是由增殖的内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞组成的肺小动脉丛状病变引起的闭塞性血管病变，导致肺动脉压力持续升高，并且最高致使右心功能衰竭和死亡[1]。PAH分为原发性和继发性，原发性肺动脉高压（PPH）是目前原因不明的一类肺动脉高压，属致命性PAH，临床较少见，包括特发性肺动脉高压（IPAH）与家族性肺动脉高压（FPAH）。继发性肺动脉高压可发生于重症慢性肺部疾病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、先天性心脏病、心脏瓣膜病、风湿性心脏病及艾滋病等，除有肺动脉高压的临床表现外，还有原发病所呈现的表现[2]。研究显示高度增殖的肺动脉平滑肌细胞（PASMC）中SOD2基因的表达水平下降，会引发氧化还原反应信号通路受损，且SOD2表达水平的下降主要是由于DNA甲基化转移酶调控的SOD2启动子区域CpG岛DNA甲基化，引起SOD2基因转录抑制所致[3]。本研究旨在探讨PAH致病B型脑利钠肽（BNP）基因启动子区域CpG岛的DNA甲基化水平表达变化与PAH患病风险的关系，为PAH提供新一轮的治疗方法，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017—2018年期间于宁波市李惠利医院治疗的风湿性心脏病合并PAH的患者60例为实验组。排除标准：（1）先天性心脏病、梅毒性心瓣膜病、感染性心内膜炎、乳头肌功能不全、腱索断裂及粘液样变性等所致的瓣膜损害；（2）精神疾病、听力障碍或语言表达交流障碍；（3）合并基础疾病，其他出血凝血疾病史，恶性肿瘤史；（4）孕产妇，HIV感染者。根据肺动脉压力（PASP）分为轻度PAH（30 mmHg≤PASP＜50 mmHg，1 mmHg≈0.133 kPa）、中度PAH（50 mmHg≤PASP＜70 mmHg）及重度PAH（PASP≥70 mmHg）[4]3组，各20例。轻度组男10例，女10例；中位年龄50岁。中度组男10例，女01例；中位年龄48岁。重度组男10例，女10例；中位年龄53岁。另选取同期心肺功能正常的健康体检者20例为对照组，男10例，女10例。本研究经医学伦理委员会的同意签署书面同意书。

1.2 试剂及仪器 基因组DNA抽提试剂盒（QIAGEN 51104），甲基化修饰试剂盒（QIAGEN），dNTP、TBE、6*Loading buffer购于上海捷兰生物技术有限公司，Taq酶（KAPA），台式高速离心机PICO 17、NANO-DROP（Thermo），BIORADPOWERPAC 3000、BIO RAD DNA SUB CELL（BIO RAD），凝胶成像系统GIS-1600购于上海天能科技有限公司，ABI 9700 PCR System（Applied Biosystems），Pyro-Mark Q96 ID（PyroMark Q96 ID）。

1.3 方法 提取血浆中DNA后利用亚硫酸盐修饰反应进行甲基化修饰，再进一步纯化亚硫酸盐修饰的DNA，进行甲基化PCR，最后进行Pyrosequencing检测。其中引物合成由PyroMark Assay Design 2.0设计，由华大基因合成。见表1。

表1 BNP引物

1.4 统计方法 采用GraphPad Prism软件对实验数据结果进行统计分析，计量资料均用均数±标准差表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

以PAH患者与正常对照组为研究对象，选取了5个位点，测定每个位点CpG岛（pos.1～5）甲基化状态。每个位点甲基化率见封三彩图1。PAH组在pos.2、pos.4、pos.5位点与对照组差异均有统计学意义（均P＜0.05）。通过比较轻、中和重度PAH与对照组，中度、重度PAH组pos.4位点差异存在统计学意义（P＜0.05）。见封三彩图2。

3 讨论

BNP广泛分布于心、肺、脑、脊髓等组织，但是在心脏中含量最高，故又称其为心脏类激素。人类合成BNP的基因片段坐落于1号染色体的短臂上，与上游的心房利钠肽（ANP）基因片段相连接，在ANP基因上游长度约为8kb的位置处，其中有3个外显子和2个内含子参与BNP的基因前体的编码，在转录成信使RNA（mRNA）时去除了2个内含子从而形成编码134肽的成熟mRNA，翻译后形成前脑利钠肽（pre-BNP）。前脑利钠肽在其分泌的过程中通过剪切去除信号肽后形成pre-BNP，这一过程是在心脏内前体剪切的，形成包含32个氨基酸残基的成熟BNP及76个氨基酸残基的成熟N端片段（NT-pro-BNP）。BNP主要表达作用于心室，然心室中BNP含量仅是心房的1%～2%，心室（特别是病理状态下的心室细胞）是合成和分泌BNP的主要位置，而心房细胞发挥重要的储藏作用。BNP在血管内发挥的作用主要是抑制平滑肌细胞和成纤维细胞的增殖，从而在血管再重塑中和调节血压的过程中起着关键的作用，与ANP相比，BNP是一个更好的反应心衰及左心室功能障碍标记物，因心肌扩张，BNP快速合成释放于血液中可以帮助调节心脏功能[5-6]。另外，BNP还有利钠利尿，抗醛固酮作用以及舒张血管和降低血压的作用。在心血管疾病中，诸如充血性心力衰竭、高血压、急性心肌梗死、心肌病和心肌肥厚等，BNP基因的表达及合成分泌较正常情况下均显著增加。在一些研究显示，血清中BNP的水平与中度PAH患者的平均肺动脉压力呈正相关，其中敏感性及特异性均比较高[7]。Leuchte[8]和Goetze[9]等的研究显示，血清BNP水平可用作一项无创的简便可靠并且稳定的指标从而对肺部疾病中PAH的程度进行评价，并可以反映中度以上的PAH的程度。

脊椎动物中3种钠尿肽基因已被证实来自于CNP-3基因的复制[10]。哺乳动物含有两个这种基因，分别是Nppa和Nppb。在基因组中，它们各自相差几Kbp的距离。BNP的上游基因存在大量的非编码区。ANF和BNP的监管序列在这些位点中随处可见，相距几个到成百上千的Kbp距离。此外，考虑到表达模式非常相似和ANF与BNP产生的过度肥厚反应，这些基因可能共用同一个监管序列。类似的例子可以在诸如Irx基因和MHC基因的其他族群基因的表达监管中发现。ANF/BNP基因族群的调控元件可能通过转录因子和心脏组织特定组蛋白修饰共同的作用而被辨别[11-12]。

2016 年笔者团队研究显示风湿性心脏病患者BNP基因启动子甲基化水平明显高于对照组，并进一步阐明了长期服用华法林抗凝的瓣膜置换术后的患者BNP基因甲基化水平高于对照组，其他影响因素中，包括年龄，性别等均做了相应对照分析[13]。基于此，本实验旨在研究风湿性心脏病患者中PAH对BNP基因启动子甲基化水平的影响，结果表明PAH患者中BNP基因启动子区域CpG岛甲基化率相对正常人显著增多，表明BNP基因甲基化在PAH发病机制中起到一定作用。尤其在PAH越高的情况下，BNP基因启动子区域的CpG岛甲基化率较正常对照组差异越明显，其在pos.4位点发现中度PAH组和高度PAH组也存在统计学差异。这说明PAH患者随着疾病的进展，BNP基因位点甲基化也逐步增多。在临床上是否可以通过识别BNP基因甲基化位点，人工诱使其去甲基化是否对风湿性心脏病继发肺动脉高压患者的疾病转归提供帮助，待进一步实验证实。