Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在心肌缺血再灌注损伤中的作用研究进展

陈亚华，陈慧

(遵义医科大学附属医院麻醉科，贵州 遵义 563000)

急性心肌梗死已经成为全世界心血管疾病的主要死亡原因之一，每年约1 800万人死于心血管疾病[1]。溶栓抗凝、手术治疗等均是恢复血流的有效方法，但血流氧供恢复后，再灌注带来的心功能不全、心力衰竭等心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)引起人们的广泛关注[2]。而线粒体自噬是MIRI中最重要的病理生理机制之一。线粒体是双膜结构的细胞器，约占心肌细胞体积的30%，主要通过氧化磷酸化合成ATP，为心肌细胞的持续运行提供能量[3]。在缺血再灌注过程中，线粒体是心肌细胞损伤和心肌细胞死亡的关键中间环节，也是主要的受损靶点[4]。受损后的线粒体通过释放大量活性氧类(reactive oxygen species，ROS)、促凋亡蛋白以及开放线粒体通透性转换孔等导致心肌细胞死亡[5]。因此，在缺血再灌注过程中清除心肌细胞中的受损线粒体具有重要意义。而线粒体自噬可选择性地降解多余或受损的线粒体，是一种以线粒体为目标的特殊自噬形式。线粒体自噬于2005年由Lemasters[6]首次提出，线粒体自噬通过调节线粒体的质量与数量维持心肌细胞的正常运行，但当受到氧化应激、缺血、缺氧等刺激时，过度的线粒体自噬或线粒体自噬不足均可影响心肌细胞的功能，甚至导致心肌细胞死亡，因此应严格控制心肌细胞中线粒体自噬的激活程度。在哺乳动物细胞中，第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten gene,PTEN)诱导激酶1[phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten gene-inducible putative kinase 1，Pink1]/Parkin介导的线粒体自噬是目前研究最广泛的线粒体自噬途径之一[7]。现就Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在MIRI中的作用予以综述。

1 Pink1、Parkin的结构及其介导的线粒体自噬

1.1Pink1、Parkin的结构 Pink1蛋白含有581种氨基酸残基，由N端线粒体靶向序列、跨膜结构域、高度保守的激酶结构组成[8]。Pink1蛋白作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶发挥作用[9]，在基础条件下，Pink1蛋白的N端线粒体靶向序列在线粒体外膜转位酶和线粒体内膜转位酶的作用下将Pink1导入线粒体内[10]，然后再经线粒体处理肽酶、早老蛋白相关菱形蛋白酶的水解，使Pink1保持在较低水平[11]。Parkin是一种E3泛素连接酶，由465种氨基酸组成，其N端是一个泛素样结构域，可以被Pink1磷酸化激活[12]，一般情况下，Parkin主要位于胞质中，其E3泛素连接酶的活性被自动抑制。

1.2Pink1/Parkin介导的线粒体自噬 Pink1/Parkin介导的线粒体自噬是目前最经典的线粒体自噬途径，因其基因突变与帕金森病相关而得名[13]。在缺血、缺氧等刺激下，线粒体由有氧代谢转化为厌氧代谢，导致电子传递链功能障碍、线粒体外膜去极化，使线粒体外膜转位酶、内膜转位酶以及相关线粒体水解酶无法正常工作，进而导致Pink1的转位和降解被阻断，从而聚集在线粒体上[14]；然后，Pink1通过磷酸化Parkin的丝氨酸65残基激活Parkin，将Parkin从自抑制状态释放出来[15]；同时，Pink1在丝氨酸65处磷酸化泛素，进一步激活Parkin[16]；另外，Pink1也可以在苏氨酸11和丝氨酸42处磷酸化线粒体外膜融合蛋白2，招募Parkin聚集[17]；最后，Parkin泛素化线粒体外膜蛋白，泛素化的线粒体外膜蛋白与微管相关蛋白1轻链3结合，将受损线粒体分离到自噬体中，再与溶酶体融合将受损线粒体降解[18]。Pink1缺失可抑制Parkin向线粒体转移，Parkin常作为Pink1的下游分子起作用，而在缺乏Pink1的细胞中，Parkin也可以转移至去极化的线粒体上[19]。Pink1和Parkin缺失均会降低细胞对受损线粒体的降解能力[20]，导致受损细胞器累积及细胞死亡。因此，Pink1/Parkin介导的线粒体自噬对于细胞生存具有重要意义。

2 Pink1/Parkin及其介导的线粒体自噬的调控

2.1Pink1的磷酸化与Parkin的泛素化调控 线粒体外膜去极化后，聚集在其表面的Pink1可以通过磷酸化泛素来激活和招募Parkin，而含EF-hand结构域2的蛋白磷酸酶可拮抗Pink1的磷酸酶，使泛素去磷酸化，抑制Pink1依赖的线粒体自噬[21]。蛋白磷酸酶PTEN-L也可抑制泛素磷酸化，阻断磷酸化泛素链的形成；此外，PTEN-L还可防止Parkin向线粒体的移位，抑制Parkin的E3泛素连接酶活性，并阻止其诱导的线粒体自噬[22]。因此，Pink1的磷酸化对Pink1/Parkin介导的线粒体自噬的发生具有重要作用。在Parkin泛素化功能的调节中，泛素特异性蛋白酶30可对抗Parkin介导的泛素化功能[23]，抑制线粒体自噬的发生。而泛素特异性蛋白酶33可以从Parkin中去除K6、K11、K48和K63连接的泛素偶联物，在Lys435处使Parkin去泛素化，抑制Parkin蛋白转移至去极化的线粒体上，从而抑制线粒体自噬的发生[24]。因此，Pink1的磷酸化功能与Parkin泛素化功能的调控可以影响其介导的线粒体自噬的激活，达到控制线粒体质量和数量平衡的目的。

2.2Pink1/Parkin基因和蛋白修饰的调控 Pink1/Parkin基因突变以及转录后的蛋白修饰均可影响线粒体自噬的功能。研究发现，Pink1的S-亚硝酰化修饰可减少Parkin向线粒体膜的转移，抑制线粒体自噬的发生[25]。在Pink1转录过程中，p53作为一种转录因子可通过抑制Pink1启动子、信使RNA及蛋白水平控制Pink1及其介导的线粒体自噬[26]。微RNA(microRNA，miRNA/miR)-27a和miR-27b基因可以Pink1信使RNA的3′非翻译区为靶点，抑制Pink1的表达，阻止线粒体上Parkin的易位和微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ的积累[27]，从而抑制线粒体自噬。另有报道显示，导向RNA设计可以重新编码Pink1(W437X)的缺失突变，挽救Pink1/Parkin介导的线粒体自噬[28]。而靶向miR-218可降低Parkin信使RNA和Parkin蛋白水平并解除其E3泛素连接酶的作用，从而负向调节Pink1/Parkin介导的线粒体自噬[29]。核呼吸因子1可同时调控Pink1和Parkin基因的转录，影响Pink1/Parkin介导的线粒体自噬，进而参与线粒体质量控制[30]。由于基因调控和转录后蛋白修饰可直接调节Pink1、Parkin蛋白水平，因此对于未来更精确把控Pink1/Parkin介导的线粒体自噬具有指导作用。

2.3氧化应激对Pink1/Parkin介导的线粒体自噬的调控 有证据表明，ROS是线粒体自噬的必要条件[31]。羰基氰化物间氯苯腙可诱导线粒体去极化和ROS的产生，促进Parkin从细胞质转移到线粒体中，然后通过线粒体自噬途径清除受损线粒体[32]。而羰基氰化物间氯苯腙的作用可能是将过氧化物酶6招募到去极化的线粒体上[33]，在Pink1/Parkin介导的线粒体自噬的初始阶段控制ROS的稳态，诱导线粒体自噬[34]。另有研究显示，邻苯二甲酸二-2-乙基己基酯作为一种内分泌干扰物可通过增加ROS的产生，降低线粒体膜电位，进而激活Pink1/Parkin介导的线粒体自噬通路[35]。除了羰基氰化物间氯苯腙、邻苯二甲酸二-2-乙基己基酯诱导的ROS应激反应外，毒死蜱、1,4-苯醌也能够降低线粒体膜电位，诱导ROS生成和Pink1/Parkin介导的线粒体自噬[36-37]。综上可知，氧化应激是Pink1/Parkin介导的线粒体自噬发生的重要调控因素，因此可以通过抑制氧化应激水平避免Pink1/Parkin介导的线粒体自噬的过度激活。

3 Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在MIRI中的作用

3.1心肌细胞中的Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在MIRI的作用 缺血再灌注损伤分为缺血性损伤和再灌注损伤两部分。Kubli等[38]利用小鼠永久性冠状动脉左前降支闭塞建立体内梗死模型，结果发现，缺乏Parkin基因小鼠对心肌梗死更为敏感，首次证明了Parkin基因在心脏中的保护作用。增加缺血、缺氧心肌中线粒体的Parkin易位，促进其参与的线粒体自噬，可以减少缺血、缺氧对心肌的损伤[39]。Siddall等[40]利用小鼠缺血再灌注损伤模型也证实了Pink1保护心肌的作用，该研究发现敲除Pink1基因的缺血再灌注小鼠的心肌梗死更显著，同时对ROS诱导的线粒体膜电位去极化也更敏感。而且，在缺氧/复氧诱导的H9c2细胞中构建高表达Pink1，可以稳定线粒体电子传递链活性，抑制ROS生成，减少缺氧/复氧导致的心肌细胞损伤[41]。综上，通过激活Pink1/Parkin介导的线粒体自噬可以显著改善心肌梗死面积[42]。因此，可以通过促进Pink1/Parkin介导的线粒体自噬，清除受损线粒体在心肌中的累积，减少MIRI时心肌细胞的损伤。

虽然缺血再灌注后上调的线粒体自噬具有心肌保护作用，但再灌注时线粒体自噬将被过度激活，因此抑制Pink1/Parkin介导的线粒体自噬可保护心肌免受缺血再灌注损伤。如Ji等[43]发现，缺氧/复氧增加了Pink1/Parkin与线粒体的共定位，激活了其介导的线粒体自噬；但经乙醛脱氢酶2激活剂Alda-1处理后，Pink1/Parkin介导的线粒体自噬被抑制，阻止了ROS和线粒体超氧化物的积累，保护心肌免受缺血再灌注损伤。Zhou等[44]在离体大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤模型中发现，Notch1可通过抑制Pink1表达以及线粒体外膜融合蛋白2和Parkin的磷酸化，抑制缺血再灌注损伤作用下的心肌细胞线粒体自噬，减少心肌细胞损伤。另有研究提出，通过药物处理可以恢复线粒体结构的完整性，降低细胞对线粒体自噬的需求，但并不是直接通过抑制线粒体自噬的过度激活而保护心肌细胞[45]，为线粒体自噬的调控提供新思路。

3.2血小板中的Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在MIRI中的作用 尽管心肌细胞是缺血再灌注损伤的潜在靶细胞，但心肌细胞损伤主要由血小板微血栓形成和微循环灌注缺陷导致。在缺血再灌注时，血小板功能活化使其黏附并聚集于受损血管壁上并形成微血栓，降低心肌灌注；同时，血小板来源的5-羟色胺可诱导中性粒细胞脱颗粒，释放髓过氧化物酶和过氧化氢，导致梗死区炎症反应增强，加重心肌梗死[46]。因此，在缺血心肌中有必要控制血小板的活化程度。线粒体功能是血小板促凝血活性的关键，而线粒体损伤可导致血栓的形成，降低循环血流。在缺氧诱导的血小板线粒体损伤中，受损线粒体可以被线粒体自噬途径降解[47]，从而降低血小板活性，最终减轻MIRI。另外，主要的线粒体自噬基因FUN14域蛋白1、类NIP3蛋白X和Parkin等被敲除后，可以引起血小板中受损线粒体的积聚，导致梗死面积增加[48]。因此，血小板的线粒体自噬是心肌细胞免受缺血再灌注损伤的主要机制之一。在正常健康的血小板线粒体中，Pink1缺失的血小板线粒体自噬功能正常，Pink1不调节正常血小板中的线粒体自噬,表明在应激状态下血小板可以通过提高线粒体自噬水平应对环境变化，发挥自我保护功能[49]。

3.3微血管中的Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在MIRI中的作用 血管壁由管腔侧的内膜、中膜和外膜三层组织构成。内膜由单层内皮细胞和内皮下结缔组织组成，单层内皮细胞可以分泌内皮素、一氧化氮等扩张血管的活性物质；中层主要由血管平滑肌细胞和弹性结缔组织组成，赋予血管壁稳定性和弹性[50]。腺苷酸活化蛋白激酶α与血管平滑肌细胞增殖及内膜增生密切相关[51]。Zhou等[52]发现，褪黑素可通过激活内皮细胞的腺苷酸活化蛋白激酶α抑制线粒体通透性转换孔开放和膜电位下降，阻止Pink1/Parkin介导的线粒体自噬过度激活，从而改善内皮屏障功能，恢复内皮细胞分泌扩血管的物质，减轻心脏微血管缺血再灌注损伤。血管平滑肌细胞的异常增殖是动脉粥样硬化形成的关键因素之一，而Apelin-13具有调节人主动脉平滑肌细胞增殖的功能。据He等[53]报道，Pink1/Parkin介导的线粒体自噬通过腺苷酸活化蛋白激酶α促进Apelin-13诱导的血管平滑肌细胞增殖，导致动脉粥样硬化形成，进而致血管腔狭窄，降低心肌灌注。另外，在氧化低密度脂蛋白处理的主动脉内皮细胞中，核受体亚家族4 A组成员1通过钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的转录后修饰调节Parkin的激活，促进其介导的线粒体自噬，从而参与内皮细胞凋亡和动脉粥样硬化形成[54]。由此可见，Pink1/Parkin介导的线粒体自噬与血管动脉粥样硬化的形成有关，但目前关于在MIRI中Pink1/Parkin介导的线粒体自噬调节血管动脉粥样硬化形成的报道较少。由于动脉粥样硬化是导致心肌缺血的主要原因之一，而对于缺血心肌有效的治疗方法为再灌注，因此未来可以将Pink1/Parkin介导的线粒体自噬、动脉粥样硬化及MIRI联系起来，以更好地预防及减少MIRI。

4 小 结

在心肌细胞和血小板中适度激活线粒体自噬有助于减少心肌梗死面积。在微血管系统中抑制线粒体自噬可以改善血管通透性，减少动脉粥样硬化的形成，确保心肌的有效灌注。但目前在血小板和微血管系统中关于Pink1/Parkin介导的线粒体自噬的研究仍较少，Pink1/Parkin介导的线粒体自噬在缺血再灌注中的作用也仍存在争议。线粒体自噬是一个动态过程，调控其适度激活具有一定难度，且在单一静态时间点用逆转录聚合酶链反应或蛋白质印迹法评估Pink1/Parkin的表达可能会产生误导性结果，因此未来需对线粒体自噬进行全面评估，以为把控MIRI中线粒体自噬的激活程度提供指导，从而减少MIRI带来的伤害。