质谱技术在常见风湿性疾病的研究进展

祝波 杨玉涛 杨梅 马武开 姚血明 黄颖 宁乔怡 蒋光芬 王璐 高雪琴

(1.贵州中医药大学，贵阳 550025;2.贵州中医药大学第二附属医院，贵阳 550003)

风湿病是指由于各种原因而引起骨、关节和周围的软组织，如肌肉、腱、滑膜和筋膜，疼痛较多的疾病[1]。本文主要对代谢组学的质谱检测技术在于风湿性免疫系统疾病(如骨关节炎、痛风性骨关节炎、类风湿性骨关节炎、系统性下肢红斑狼疮、强直性柱炎)代谢标志物的筛选的研究进行归纳及展望。报告如下。

1 质谱技术的分类、原理及优势

质谱,通常又被广泛称为分子质谱法,临床上常用的方法是有机质谱激光仪器,如液相化学色谱-质子基谱激光联用仪(LC-MS)、气相色谱-质子基谱激光联用仪(GC-MS)、傅里叶时间变换激光质谱仪(FT-MS)以及辅助基质激光辅助质谱激光用于解吸太空飞行器的时间变换质谱仪(MALDI-TOFMS)等四大质谱类。它主要功能是将分析样品中的分子转化成各种带电中性离子,并通过利用样品相应的离子电场、磁场原理来准确实现中性离子键与m/z键的分离,从而准确检测每种中性离子的带电峰值和强度也是进行离子物质化学分析的一种仪器。与其他传统生化免疫分析方法相比，该方法具有特异性高、灵敏度高、检测限低、分析速度快等明显优势，使其在临床微生物标记物的检测方面极具潜力，筛选作用高效，可应用于临床免疫生物学、分子生物诊断、临床生物化学研究、微生物检验研究等方面[2]。

2 质谱技术在风湿性疾病的相关应用

2.1骨性关节炎(osteoarthitis,OA) 骨关节炎是以关节软骨变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病，主要由关节软骨细胞、软骨外基质、软骨下骨质合成及降解的平衡破坏导致的，多见于中老年人[3]。目前对骨关节炎发病的发病的分子尚不完全明确，且对其生物标记物的研究的报道并不是很多。通过 GC-MS 对骨关节炎患者的尿液进行研究，发现患者尿液中的三羧酸循环(TCA)呈上调趋势的原因与骨关节炎相关[4]。余光书等基于质谱技术分析软骨细胞线粒体蛋白质及细胞凋亡机制的研究，对膝关节表面置换术患者的关节软骨组织提取线粒体进行分析鉴定，共发现294个蛋白质点的蛋白质有ATP合酶、超氧化物歧化酶、谷氨酸脱氢酶1等14种蛋白质存在于此线粒体并对软骨细胞线粒体中的蛋白质作全面的定性观察[5]。Carlson AK等运用高效液相色谱-质谱法对骨关节炎患者及健康人的关节滑液进行整体代谢组谱分析，确定35种代谢物为骨关节炎的潜在生物标志物[6]。Zhang在OA患者的关节滑液中发现6种差异代谢分子并证实谷氨酰胺、 5-脱水葡糖醇以及葡萄糖内酯组合可显著区分OA患者与健康人群，单-分子葡萄糖内酯则可有效区分OA与RA患者[7]。运用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱技术(UPLC/Q-TOF-MS)对重度骨关节炎患者的硬化的软骨下骨进行检测分析，其中与软骨下骨硬化密切相关为牛磺酸、β-丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸、嘧啶、嘌呤、神经鞘脂，而与骨关节炎软骨下骨硬化最为相关为牛磺酸、β-丙氨酸,并发现左旋肉碱、牛磺酸、甘油磷脂等分子在软骨下骨硬化的发病机制中有着重要的调节作用；而β-丙氨酸和左旋肉碱最有可能是软骨下骨硬化的耗能代谢物[8]。综上质谱技术在骨性关节炎疾病鉴定和对生物细胞标记物的研究过程中一直起着至关重要的指导作用,通过质谱鉴定提取出有重要意义的差异生物标记物并对其分别进行该病相关细胞生物学和代谢因子通路的分析研究,将极大有助于初步了解该相关疾病的具体发病变化机制,对于早期疾病诊断及初步探寻该病相关的临床靶向生物治疗方法提供了可靠的科学依据。

2.2痛风性关节炎(gouty arthritis,GA) 痛风是由于嘌呤代谢紊乱，尿酸盐在关节囊、囊、软骨、骨、肾皮下等组织内沉积而引起的一种疾病，容易发生疾病和炎症，多见于跖趾关节、踝关节等，多见于中老年男性。运用质谱技术寻找差异性标志物，并分析标志物的相关代谢通路，去探究痛风性关节炎的发病机制。运用UHPLC-Q-TOF / MS技术并结合多变量分析方法对AGA模型大鼠的血浆的生物标志物进行分析，确定AGA的内源性代谢物，探寻AGA的发病机制，为疾病的预防，检测和诊断提供可靠的依据[9]。陈娇等运用GC-MS的代谢组学方法对痛风患者的血清代谢进行分析发现痛风病人的血清代谢谱与健康人的血清谱存在差异[10]。而于栋华等使用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱方法对痛风性关节炎的肾脏进行代谢组学研究，发现牛磺酸和亚牛磺酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢与肾脏代谢有关，且牛磺酸和草酸是其涉及的内源性生物标志物[11]。张宁等利用超高液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-TOF-MS)研究了总皂苷对急性疼痛的干预作用，确定了风湿性关节炎的7种潜在生物标志物包括麦角钙化醇、软骨素、甘油磷酰胆碱、乙二 酸、廿二碳六烯酸、牛磺酸和甲羟戊酸[12]。

2.3系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE) SLE是一种典型的自身免疫性结缔组织疾病，发病机制复杂，临床症状多样，给SLE的诊断和监测带来挑战，代谢组学作为后基因新兴的组学技术，为寻找新的生物标志物提供新策略和新思路。采用2-DE和MS检测小鼠HL-60细胞的蛋白表达发现早期用热休克蛋白60和α-烯醇化酶等6种细胞质和核蛋白激活B细胞自身抗原相应的SLE自身抗体数量也会增加，这为SLE患者的发病机制提供了一定的依据[13]。王燕妮等运用质谱方法发现钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶可能是新的系统性红斑狼疮候选抗原[14]。俞颖等通过液相色谱串联四极杆飞行时间质谱系统对系统性红斑狼疮患者血浆样本进行代谢指纹图谱进行分析，发现SLE的患者与健康者代谢指纹存在明显差异，并发现SLE的血清当中的氨基酸、磷脂和卜啉呈高上调的趋势[15]。Yan R采用GC-MS发现SLE患者粪便代谢产物与系统性红斑狼疮活动指标密切相关[16]。ZhangQ采用液相色谱-串联质谱对SLE患者和健康对照者(HCS)的血清进行代谢谱分析，该研究表明血清代谢谱在SLE患者和HCS患者中是不同的，L-焦谷氨酸升高是SLE的一个有希望的双模式标志物[17]。

2.4类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis ,RA) RA是一种慢性非化脓性炎症疾病，属于自身免疫性疾病，常好发于手关节、膝关节、趾骨间关节[18]。目前，诊断RA主要靠临床免疫学检查及相关的影像学的手段，而疾病的发生往往最开始是功能及分子标志物的改变，继而才是形态学的改变。运用蛋白质组学的方法对RA的研究寻找参与发病机制的生物标志物，这为临床上诊断RA有着重要的意义。研究发现，运用MALDI-TOF- MS技术对于RA湿热瘀阻证、非湿热瘀阻证及健康志愿者的血清进行检测，筛选出其特异的生物学标志物并研究了发病机制[19]。Ran Noh等采用MALDI-TOF-MS技术，对RA患者血清及关节液进行分析，推测STEAP4和ZNF658可作为RA的特异性蛋白质，有一定的诊断意义[20]。在类风湿性关节炎寒热证候基因表达谱的研究发现：3-氧-丙酸、L-脯氨酸、尿素、5-氧-脯氨酸、核糖醇、纤维醇为在热证中呈高表达，L-亮氨酸在寒证中呈高表达[21]。利用代组学方法对类风湿关节炎兔血浆代谢物进行影响，发现有尿苷、肌酸酐呈上升趋势，壬二酸和苯甲酰氨基酯呈下降趋势[22]。用串联质谱法对活动期RA患者血浆中DMARD代谢物浓度，发现携带rs1476413SNP、TT或CT等位基因的患者的血浆多谷氨酸代谢产物显著升高，相应的疾病活动性评分也相应升高[23]。采用iTRAQ联合Nano LC-MS/MS技术筛选出早期RA患者的差异的蛋白，并分析了差异蛋白主要的细胞定位、分子功能及参与的生物学过程、主要信号通路，再进一步分析这些差异蛋白相关通路，发现这些差异蛋白与早期RA的发病机制密切相关[24]。运用GC-MS技术研究了蛇葡萄(AA)提取物对大鼠胶原性关节炎的代谢影响，发现了AA治疗类风湿关节炎的20个特异性生物标志物和3个相关代谢途径，为代谢组学生物标志物在类风湿关节炎的确认和验证提供了新的视角[25]。Blaschke S等采用凝胶电泳(2D-DGE)分离和质谱(MS)研究法并Western blot分析验证法首次确定和验证了结合珠蛋白-α1、-α2、，维生素D结合蛋白和载脂蛋白C-Ⅲ作为类风湿关节炎预测依那西普药物疗效的潜在生物标志物[26]。

2.5强直性脊柱炎(ankylosing spondylits,AS) AS是主要影响骶髂关节、脊柱和四肢大关节的慢性炎性疾病，以髋关节受累为主，严重会导致畸型。运用该技术寻找高灵敏和特异的AS生物标志物,为临床上早期诊疗AS提供帮助。研究发现AS患者与健康者的代谢产物存在差异及不同性别之间也有一定的差别，发现脂类和烷烃为AS粪便的主要特征，大部分与AS患者的疾病有关，并发现了葡萄糖酸和α-l-半乳呋喃糖苷在AS患者肠道中的含量增加，推测与AS患者血糖升高有关[27]。Jing利用MS发现AS患者血清中结合珠蛋白前体表达上调，其抗原决定因子与HLA-B2705 (HLA-B27亚组)相关，推测AS的发病机制也可能与结合珠蛋白的前提有关[28]。Gao等采用气相色谱/质谱(GC-MS)和液相色谱/质谱(LC-MS)技术和代谢组学方法对AS患者血浆代谢产物进行分析，发现患者血浆中脯氨酸、葡萄糖、磷酸盐、尿素、甘油、苯丙氨酸、同型半胱氨酸浓度升高，磷酸、色氨酸二肽-苯丙氨酸浓度降低[29]。而在动物实验研究中，发现艾灸能改善AS小鼠的整体健康模型，可降低其爪子厚度和组织中IL-1β、PGE水平、IL-6和TNF-α在AS小鼠中的表达及发现艾灸对TCA循环、脂质代谢、氨基酸代谢、肠道菌群代谢和嘌呤代谢表达有逆转作用，能够进一步了解艾灸治疗AS的机制[30]。

2.6干燥综合征(Sjogren,s syndrome,SS) SS皮炎属于一种自身机体免疫系统疾病，以直接侵犯外分泌腺组织为主，常见的表现在发热口干，腮腺下部肿大，眼睛酸涩痛等多种临床表现，有时也甚至可直接累及多个神经器官。Kageyama G等用GC-MS分析原发性干燥综合征(PSS)患者与健康者(HCS)的唾液，发现PSS患者唾液代谢物多样性降低，甘氨酸、酪氨酸、尿酸和岩藻糖的含量相对减少，据此推测引起唾液腺破坏的原因有可能是由于慢性涎腺炎引起的[31]。

综上所述，代谢组学的质谱技术凭借其特有的优势，在风湿性常见疾病的生物标志物的研究当中具有很重要的意义，通过对其相关的生物标志物研究可以发现参与其发病机制的微生物，对疾病的早期诊断、预测及治疗提供了相关依据。

3 展 望

患者血清本身抗体的形成是风湿病的主要表现，特异抗体和具有标志性的生物标识对疾病诊断起着举足轻重的作用。虽然质谱技术目前还处于发展的阶段，但质谱技术是一种新的技术手段，对寻找潜在生物标志物有着重要意义，它可以显示疾病发生的机制，用于早期疾病诊断，实现靶向性治疗，此外还可以用来评估治疗效果和判断预后。该技术将在未来临床诊断中发挥重要作用，具有巨大的发展空间和前景。未来随着质谱技术的不断发展成熟，将会在风湿免疫学疾病中广泛开展研究，必将带动风湿病学新的发展。