生长因子纳米载药系统促进组织修复的研究

胡晨波，彭俊木，钟伟洋，唐 可，权正学

（重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 400016）

生长因子（growth factor）是一类作用于特定细胞表面的跨膜受体，可调节细胞增殖、迁移、分化等行为的蛋白质，对人体发育、代谢具有重大作用。研究表明[1-4]，生长因子在修复组织损伤，促进血管、骨骼甚至周围神经等组织再生等方面同样具有广泛的生物学价值和应用前景。然而，现有的生长因子临床应用与理论仍然存在巨大差距，首先，生长因子作为一种蛋白质，在体内半衰期较短，在体内蛋白酶的作用下，多种生长因子在进入体内后迅速失活；其次，直接摄取高剂量的生长因子对机体有一定的毒副作用[5-9]，成为生长因子类药物应用推广的“瓶颈”。纳米载药技术的出现，为克服生长因子临床应用的局限提供了可能。通过基于各种人工合成的新型材料的纳米载药系统，生长因子能够精准、持久地释放于人体特定部位[10]。本文就纳米载药系统的概述及优越性、常见纳米载药材料的分类、生长因子纳米载药系统的应用及其不足及改进策略作一综述

1 纳米载药系统的概述及优越性

纳米载药系统是粒径在纳米级的新型微小给药系统的统称，通过纳米技术，以天然或合成的高分子材料作为载体，制成粒径为1～100 nm 的药物输送系统，达到给药的目的[11]。纳米材料运载药物的方式通常为药物直接包载在纳米载体的骨架中，或药物通过共价连接修饰在纳米载体表面[12]。对于多肽类或核酸类等容易被降解的药物而言，纳米载体不仅不会降解药物或降低药物活性[13]，且纳米载体提供的理化屏障能保护载体中的药物，减少其降解，延长其在体内的循环时间。同时，通过不同纳米材料的自身性质及研究者为达到研究目的对载体的特定修饰，纳米载药系统能一定程度地控制药物的在体内的浓度和分布[14]，是药物控释及靶向给药未来的研究重要之一。纳米复合物目前常用于治疗骨缺损的研究，部分研究已经转化为临床应用，获得了令人满意的效果[15]。

2 常见纳米载药材料的分类

2.1 基于脂质体的载药系统 脂质体（liposome）由亲水亲脂两性分子模拟细胞膜结构构成，能够包载不同形式的药物，具有可降解、毒性低、生物相容性强等有点，自从1965 年Alec Bangham 及其同事描述了磷脂系统，Gregoriadis 首次提出脂质体可用于药物在体内的运输以来，脂质体载药系统迅速成为了经典而常用的载药系统[16]。利用生长因子类药物作为运载药物的实验研究也证实了脂质体载药系统的载药性能。Shields LBE 等[17]利用122 只Wistar 大鼠，通过拔出其上颌牙，于牙槽中填充不同的物质，比较不同载药材料对于大鼠牙槽骨缺损修复的影响，结果发现填充骨形态发生蛋白4 脂质体或填充TGF-β1的实验组同期的骨小梁含量和血管数量均大于用PBS 作为填充的载药材料的对照组，表明脂质体作为载药材料运载生长因子能促进牙槽骨缺损的修复过程。Jeon S 等[18]将重组人表皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF）包封入纳米脂质体中，测量其经皮释放性能，透射电镜和显微分析结果显示粒径约150 nm 的均质球形脂质体囊泡通过增强脂质体穿过皮肤毛孔，增强了重组人表皮生长因子在鼠皮肤中的渗透和定位。

然而，第一代脂质体对于部分药物载药率低下，药物难以保留在脂质体中，且传统的脂质体模型容易被肝、脾等部位的单核巨噬细胞系统摄取，减弱其治疗效果。为此，科研工作者们进行了大量的研究改进脂质体作为载药材料的性能[19-20]，如将聚乙二醇与脂质体连接等。近年来，刺激响应性脂质体获得了科学界的关注。刺激响应性脂质体在体内循环到达靶向部位后，脂质体双分子层结构或构型发生变化，释放运载药物，实现药物的靶向释放，提高药物治疗靶向效率，降低药物不良反应[21]。以温度刺激响应脂质体为例，在高于体内生理温度的情况下，热敏脂质体从凝胶态转化为液晶态，脂质体渗透性大幅增加，运载药物从脂质体中渗出，从而达到靶向载药效果。基于此原理，二棕榈酰磷脂酰胆碱（dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）以其独的熔融相变温度（41.4 ℃）成为主要的热敏脂质体的主要材料。在核磁共振的引导下，操作者可在检测热量聚焦和药物浓集的同时，通过从外部调整聚焦温度从而控制药物释放，在载药领域有着广泛应用前景[22]。一项以纳米脂质体水凝胶运载bFGF 及牛血清白蛋白的研究显示[23]，纳米脂质体载药系统的平均大小为232 nm，并具有58%的总蛋白包封率，并可增强人脐静脉上皮细胞的增殖。脂质体纳米载药系统现存的主要问题是进一步提升载药效率及克服不饱和脂肪酸脂质体在体内酶影响下解离。

2.2 基于固体脂质纳米粒和纳米结构脂质的药物运载体系 固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）以固相脂质为骨架，加入表面活性剂构成的药物载体。常用的SLN 制备方法有高压均质化、超声均质化、高速均质化、溶剂乳化、超临界流体乳胶萃取、蒸发或扩散等[24-26]。与传统的脂质体载药系统相比，SLN 载药系统稳定性高，缓释时间更长[27，28]。Silva AC 等[29]曾对一种SLN 系统开展长达2 年的研究发现，于生产时的94.9%的包封率相比，在25 ℃和4 ℃下贮存2 年后的SLN 系统包封率分别为91.9%和93.3%，仅有小幅下降，体现了SLN 系统的稳定性。自1991 年问世以来，基于不同的原理，各类SLN 载药策略不断被设计和研究，如抗体介导的SLN、磁性靶向SLN、pH 敏感型SLN、阳离子SLN 等[30]。以阳离子SLN 为例，Kuo YC 等[31]比较了搭配不同阳离子的肝素化SLN 纳米微粒运载NGF的性能，不仅发现肝素和NGF 运载效率和纳米微粒的胆固醇重量百分比增加而增加，与硬脂酰胺相比，以酯季铵盐为阳离子的SLN 载药系统具有更强的诱导多能干细胞生存能力，在神经分化过程中诱导多能干细胞膜电位的调控上具有客观的研究前景。然而，由于主要结构为固体脂质，晶体结构也使SLN仍存在结合率较低、载药量较小等缺点，同时不可预测的凝胶化趋势也是SLN 值得关注的问题。

纳米结构脂质体（nanostructured lipid carrier，NLC）即在SLN 基础上在其固态的核心区域加入甘油后的改良体系，在载药性能上继承了SLN 的优点，同时载药量更大，其中的液体成分防止了药物在存贮过程中的排出，近年来研究表明NLC 能提高水溶性差的口服药物的生物利用度，具有广大的应用前景。有研究以甘油二酸酯和油酸以高压均质化后制备得NLC，在将其用于运载西利马林的体外实验中，结果发现纳米颗粒仅10 min 内即大量脂解，之后分为脂相、水相和沉淀相3 个阶段，在水相中药物大量溶解，从而提高了难溶口服药物的生物利用度，这可能与脂质体分解后的消化产物和胆盐混合而成的分子团有关，表明与益肝灵颗粒和传统的西利马林分散片相比，纳米结构脂质体运载药物的生物利用度分别提高了2.54 倍和3.10 倍[32]。尽管目前并无证据显示NLC 比SLN 具有更低的生物毒性，目前为止，投入市场的NLC 产品数量也仍然有限[33]，但NLC 所具有的独特优势，使其值得在生长因子载药中得到进一步的关注。

2.3 基于多聚物的纳米药物运载体系 高分子聚合物纳米粒由自组装的双亲聚合物组成。根据其性质分为天然高分子聚合物纳米粒和合成高分子聚合物纳米粒。常见的聚合物纳米粒有壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸交酯（polyglycolide，PGA）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolicacid），PLGA]等。聚合物纳米粒已在化疗药物载药、疫苗载药、基因药物载药方面得到长期应用，其中PLGA 作为一种新型人工合成的高分子聚合物，具有在生物体内可降解、药物相容性好、降解产物毒副作用小等优点，已通过FDA 批准，成为纳米载药系最常用的材料之一。Chereddy KK 等[34]运用PLGA 运载血管内皮生长因子治疗糖尿病小鼠，研究发现与单独使用血管内皮生长因子相比，PLGA 纳米微粒在mRNA 水平上调了VEGFR2 基因的表达，小鼠伤口肉芽肿形成过程中胶原蛋白更多，上皮化程度和血管生成程度更高，表现了PLGA 纳米微粒在伤口愈合中的强大载药潜力。另有研究表明[35]，一种含有带正电荷的重组人bFGF 和带负电荷的海藻酸钠的多离子复合物PLGA 纳米片，在相同促进小鼠伤口肉芽增生和血管生成的情况下，纳米片的bFGF 处理剂量仅约为传统喷雾治疗所用bFGF 剂量的1/20。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的衍生物，广泛存在于甲壳动物的外壳和高等植物的细胞壁中，具有良好的生物相容性、生物可降解性，甚至抗菌活性[36]，既可以单独运用于周围神经系统的修复，也可作为多聚物材料以多种形式运用于药物控释。有研究将运载骨形态发生蛋白2 的壳聚糖-三聚磷酸酯（chitosan-tripolyphosphate）纳米微粒覆盖于钛合金材料上，在体内和体外实验中都检测到了骨形态发生蛋白2 良好的生物活性[37]。除纳米微粒外，壳聚糖还可以海绵、凝胶、薄膜、甚至支架等多种形式运用于药物运载和组织工程[38，39]。然而，目前对于壳聚糖运载药物的体内研究较少，同时，壳聚糖的制备多来源于甲壳类动物（如虾、蟹、昆虫）的外壳乙酰化。对壳聚糖提取纯度、杂质种类及含量、安全性的要求尚缺乏统一标准，其制作方式也有改进的空间[31]。

2.4 基于蛋白质的纳米药物运载体系 蛋白质作为载药材料的出现晚于脂质体和多聚物，但蛋白质纳米微粒制备简便，溶解产物为氨基酸，再利用性强，同时由于蛋白质微粒的带电荷氨基酸多，可携带更多种类的蛋白质药物。蛋白质纳米微粒的载药策略主要有自组装和解溶剂化两种方式。常用的蛋白质材料有白蛋白、乳球蛋白、鱼精蛋白、白明胶、麸朊、豆球蛋白等，其中以白蛋白作为材料的载药体系最引人关注。

Sun H 等[40]研究发现，卵清蛋白（ovalbumin）作为添加剂保护神经生长因子的性能要优于PEG、牛血清蛋白和葡萄糖；在体外实验中，由于卵清蛋白的保护作用，实验第10 天时神经生长因子能保持高于80%的活性，即使在28 d 后也能保持40%的活性。Zhang S 等[41]将聚乙烯亚胺覆盖于牛白蛋白纳米微粒上，结果发现聚乙烯亚胺可以控制骨形态发生蛋白从纳米微粒中释放，但并没有促进新生骨形成及增加骨形态发生蛋白的运载量，但减少聚乙烯亚胺用量之后，骨形成效应增强，推测可能是聚乙烯亚胺在体内的积聚增强了纳米微粒的毒性，影响了新骨的生成，而进一步优化纳米载药系统，可减轻聚乙烯亚胺的毒性作用。Zhang S 等[42]后续研究中将PEG与聚乙烯亚胺联合覆盖于牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)纳米微粒上，与单纯覆盖聚乙烯亚胺的BSA 纳米微粒对比，虽然7 d 后的药代动力学检测PEG-PEI 联合覆盖的纳米微粒所剩余的骨形态发生蛋白2 较PEI 覆盖的牛血清白蛋白纳米微粒中骨形态发生蛋白2 剩余量低，但前者诱导新骨形成的作效应远较后者明显。Li L 等[43]以牛血清白蛋白为原料研发出纳米粒子嵌入式电纺纳米支架，用其运载骨形态发生蛋白2 和地塞米松，体外实验可检测到骨形态发生蛋白2 释放时长可长达35 d，体内实验显示运用纳米纤维支架的实验组颅骨修复程度与空白对照组相比明显提升。

2.5 其他用于纳米载药系统的生物材料 介孔二氧化硅（mesoporous silica）是一种无机材料，其颗粒结构稳定，生物相容性优良。自从Kresge CT 等[44]首次报道了M41S 有序介孔二氧化硅家族以来，介孔二氧化硅在载药领域得到了日渐深入的研究。与其他载药材料相比，介孔二氧化硅的主要优势有：介孔二氧化硅的多孔结构，使其具有高比表面积，能摄取更多的药物[45]；通过改变孔径等参数或在其表面进行多聚物修饰等方法，可明显改善药物释放的性能。但同时有研究表明二氧化硅颗粒可引起小鼠肝脏的炎症、坏死等反应，甚至引起子代的并发症，其中Yamashita K 等[46]将二氧化硅和二氧化钛纳米微粒静脉注射入怀孕小鼠体内后，在胎盘及胎鼠的肝、脑中均发现了纳米微粒，且经过纳米微粒注射后的孕鼠子宫和胎鼠均较未经处理的对照组小鼠的子宫和胎盘小。Fu C 等[47]研究也发现，将注射的二氧化硅纳米微粒的表面用氨基和羧基修饰后，上述毒副反应可以消失。以上研究都为进一步降低二氧化硅作为载药材料的毒副作用提供了思路。

磁性材料为纳米载药系统设计提供了新思路。基于磁性纳米微粒的载药系统多以金属或金属氧化物为材料，可在体外磁场的作用下，到达特定靶器官或靶细胞，其特异性高，在影像诊断、组织工程、生物传感等领域发展潜力巨大[48-51]。磁响应复合支架调控生长因子释放的前景广阔，甚至磁性材料可运用于组装、构建复杂的组织结构[52，53]。在展现出如此强大性能的同时，以金属氧化物为材料的纳米微粒在体内作用产生的副反应也不容忽视，其在体内产生的活性氧可引起DNA 损伤、线粒体功能受损、染色体收缩、凋亡小体形成等一系列不良反应，对磁性纳米微粒在机体内代谢、清除、免疫反应和毒性展开研究有助于预测纳米毒性[51，54]。Wang Q 等[55]研究了聚丙烯酸（PAA）-钴-3-（二乙胺）-丙胺（DEAPA）磁铁矿纳米粒子（PAMNPs）的生物特性，研究表明聚丙烯酸（PAA）-钴-3-（二乙胺）-丙胺（DEAPA）磁铁矿纳米粒子主要分布在肝脏和血液中，在血浆中半衰期为3.77 h。在小鼠体内的实验中，纳米粒子可迅速代谢，且未引起任何毒性或不良反应[56，57]，提示磁性纳米微粒表面包覆其他材料可能是一种可行的降低毒性的方法。目前，磁性纳米材料在体外调控表皮组织、血管组织、骨骼肌组织甚至肝脏组织按照特定结构生长已经得到了满意的结果[58]，磁性纳米材料将是未来组织修复及组织工程中热门材料之一。

3 生长因子纳米载药系统的应用-以骨组织修复重建为例

骨骼修复再生，是组织修复领域的热点、难点[59]。骨不连是临床上常见的疾病，创伤后的骨折不愈合增加了患者经济负担，给患者健康和生活带来严重危害，因此骨不连的治疗具有重要临床意义。随着目前临床交锁髓内钉、外固定支架、带血管蒂骨瓣移植等治疗骨不连的手术方式逐渐成熟[60]，对于骨组织的基础研究，尤其是骨组织修复重建的研究成为新型骨不连治疗方式的突破口。生长因子在骨骼修复重建过程中起到重要作用。骨折后，骨形态发生蛋白诱导骨骼生成，血管内皮细胞生长因子诱导骨折部位血管生成，而血小板衍生因子、转化生长因子和β 成纤维细胞生长因子调控骨细胞增殖分化[61，62]。传统的支架材料可提供良好的弹性模度，有利于细胞粘附，同时其多孔结构可促进细胞增殖，但难以调控细胞进一步分化。为提高生长因子药物促进成骨的效率，降低不良反应，支架结合纳米微粒组合成的生长因子载药系统应运而生[63-65]。

目前关于促进成骨的纳米载药系统以运载BMP-2 为主，并且多以肝素作为稳定剂，但同样有大量运用纳米载药系统运载自体间充质干细胞的研究[66-68]。Crasto GJ 等[69]研制出新型纳米脂质体，该脂质体通过超声刺激释放BMP-2，将该脂质体装入可吸收胶原海绵，一同植入小鼠股二头肌中，经超声刺激后，通过微量CT 及组织切片等方式，证实了纳米载药系统在体内良好的成骨活性及控释过程中的安全性。Ma C 等[70]也利用自行设计的注射用纳米微球纤维颗粒运载BMP-2 成功修复了大鼠颅骨缺损。

4 纳米载药系统的不足及改进策略

4.1 纳米载药系统运载生长因子类药物目前问题 虽然目前的纳米载药材料研究取得一定进展，能解决传统给药途径的部分缺陷，但用运载生长因子类药物的纳米载药系统仍存在以下问题，如相关研究过少，现有大部分研究仍然主要聚焦于纳米载药材料在肿瘤诊断、治疗领域的应用，将纳米微粒用于运载生长因子类药物的研究相对较少，尤其是各种新型纳米材料，其性质尚处于研究阶段，将其用于运载生长因子的相关研究则更少。同时，纳米载药系统本身尚存的不足也给新型载药材料的应用带来了挑战。

目前所研究的纳米微粒于体内具体作用机制仍不确切，具有潜在毒性、致癌性及致畸性，随着纳米微粒在体内生物聚集，其对于人体的风险可能随之增加。除介孔二氧化硅以外，Knudsen KB 等[71]以小鼠作为研究对象，研究阳离子聚合物及脂质体纳米微粒的毒性时发现，给小鼠静脉注射阳离子胶束和脂质体后，小鼠肺、脾脏中的DNA 链断裂明显增加。目前国际上并无统一的纳米材料对人体的风险评估标准[72]，因此纳米材料的安全性尚需更多理论依据、实验数据及循证医学证据以进行评估。

此外，纳米微粒作用于生物体内的过程中仍然普遍存在靶器官靶组织内浓度不高等问题。多项体外研究表明大多数纳米微粒直径在10～60 nm 时，表现出最大的细胞摄入量。在生物机体内部，情况则更为复杂，一方面直径过小（＜10 nm）的纳米微粒容易被肾脏的滤过屏障滤过并随尿排出，难以在生物体内特定区域聚集，而直径过大的纳米微粒（＞200 nm）则会激活补体系统，沉积在肝脏和脾脏中[73]。因此，在未能完全保证纳米药物的安全性之前，目前纳米材料运载生长因子的研究体外实验占多数，大多数体内研究也局限于动物实验模型阶段[74]，且临床试验可能得到与动物实验不完全一致的结果[75]。

4.2 纳米载药系统的改进策略 面对现今纳米材料临床应用的局限性，新型纳米材料的设计，尤其是纳米材料相关性质的研究或将成为改变现状的突破口。随着材料学不断的发展，纳米微粒的设计和修饰受到越来越多学者的关注。即使是同一纳米材料，通过改变其大小、形状等性质，也会有不同的生物效应。细丝状的纳米多聚物分子团在循环中的有效期可长达多于1 周，远高于与之对比的球状纳米微粒的有效期[76]（2～3 d）。而将传统的纳米载药系统加以修饰，也可显著提高纳米微粒的性能[77]。多种材料联合应用也是纳米载药系统的改进策略之一。利用多种纳米材料的特性，可以克服单一纳米材料的不足，有极大的研究价值及可行性，目前已经在动物实验中获得了满意的效结果[78-80]。

5 总结

纳米载药系统延长了药物在体内的作用时间，调控了药物在体内特定器官及组织释放，达到了药物缓释剂靶向载药的目的，且新型纳米载药系统的研发也取得了众多成果。但延长药物在体内循环时间、实现特定部位靶向聚集只是新型纳米载药材料所需特性的一部分，将载药材料转化为临床成果更需考虑材料学、医学、经济学等各方面因素。未来，进一步研究纳米材料在不同组织中作用效率的差异，探究生长因子修复组织的分子机制也将为生长因子载药体系的构建提供新的思路，从而为损伤修复和组织再生提供新工具、新方法。