细胞间隙连接蛋白43在骨质疏松领域研究进展

李昊天,邱涛,陈超综述 王春庆审校

骨质疏松症主要的临床症状有躯体疼痛、驼背、身高短缩、脆性骨折等，尤其是股骨转子间骨折、股骨颈骨折等。它是使老年人生活质量降低的重大慢性疾病之一，骨折尤其是髋部骨折后1年内病死率较高。我国已进入人口老龄化社会，骨质疏松症发病人数每年增多，骨质疏松骨折发病人数也逐年升高，给家庭、国家带来了沉重的负担[1-5]。正常的骨重建是由成骨细胞群为主的骨形成与以破骨细胞群为主的骨吸收保持动态平衡实现的。目前对骨质疏松的基本病理认识是成骨和破骨系统失衡，破骨增加，成骨不足导致骨吸收，骨小梁破坏，脆性增加，骨折风险增加。骨骼发育和骨重建需要多种类型的细胞协调，包括成骨细胞、破骨细胞等。实际上，细胞内外的自分泌和旁分泌信号对骨骼发育和骨重建都是至关重要的。一种协调细胞功能的有效方法就是通过间隙连接进行细胞间信号传导[6-7]。

1 细胞间隙链接

细胞间隙连接(GJIC)维持细胞之间的代谢连续性，并介导小分子的快速有效传输，包括相互连接细胞之间的第二信使。间隙连接通道是由并列存在于相邻细胞上的两个半通道并排形成的跨细胞通道组成的，在间隙连接处形成间隙连接板。间隙连接通道是一类膜通道，由跨膜通道形成的整合膜蛋白组成，这些蛋白称为连接蛋白，内毒素或泛新蛋白，它们介导几乎所有动物组织中直接的细胞间或细胞间的细胞外通讯。这些通道的活性受到严格调节，特别是通过分子内修饰(如蛋白质的磷酸化)及通过形成多蛋白复合物进行调节。支架蛋白将信号酶、底物和潜在的效应子(如通道)连接到可以锚定于细胞骨架的多蛋白信号复合物中。蛋白质间相互作用在通道定位和活性中起着至关重要的作用，并且除了在通道间形成功能外，间隙连接蛋白似乎还参与了不同的细胞功能(例如转录和细胞骨架调节)[8-9]。

细胞间隙连接允许相邻细胞之间离子、核苷酸、小分子和第二信使的直接交换。此外，间隙连接通道并不是孤立地发挥作用，而是聚集成可以包含数千个通道的间隙连接板，其直径范围从<100 nm到几微米。因此，GJIC可以为一个动态的、互连的单元网络提供途径。除了经典的GJIC外，在细胞膜上还存在间隙连接半通道，它们起着直接连接胞浆和细胞外环境的作用[10-11]。有研究证实，骨和骨细胞中观察到3种细胞间隙连接蛋白(Connexin，Cx)的表达，分别为Cx45、Cx26、Cx43，其中Cx43表达最明显[12]。在骨中GJIC允许不同细胞类型之间的细胞—细胞通信，包括成骨细胞—骨细胞、骨细胞—骨细胞等。就成骨细胞而言，成骨细胞体外分化需要间隙连接通讯，而缺乏Cx43小鼠原始颅骨成骨细胞合成矿化细胞外基质减少，表明Cx43在调控成骨细胞分化中起到作用。

2 细胞间隙连接蛋白43在骨重建中的作用

2.1 细胞间隙连接蛋白43 细胞间隙连接蛋白43(Cx43)直接调控细胞间的连接通讯,进行信息和能量的传递,进而调控细胞的新陈代谢和增殖分化等一系列生理过程,在脊椎动物早期的心血管发育/神经系统传导、骨骼形成和矿化中发挥重要作用,同时与心血管系统、泌尿生殖系统、神经系统等多种系统疾病的发生发展密切相关[13-14]。Cx43在骨功能和发育中起重要作用，在成骨细胞或骨细胞中靶向缺失Cx43可导致骨细胞凋亡增加、破骨细胞募集和生物力学性能降低。Cx43同时形成间隙连接通道和半通道，分别介导相邻细胞之间或细胞与细胞外环境之间的通讯。Cx43形成间隙连接、半通道分别介导相邻细胞间以及细胞和细胞外环境的通讯[15]。成骨细胞或骨细胞中Cx43的缺失可造成骨折延迟愈合或不愈合。为研究在骨细胞中，两个通道分别在骨重建中起到的作用，有研究分别建立了两个由10kb-DMP1启动子驱动的Cx43显性阴性突变体的转基因小鼠模型：R76W(间隙连接被阻断，而半通道被促进)和Δ130-136(间隙连接和半通道都被阻断)。实验结果显示，R76W小鼠(促进半通道)显示新骨显著增加，而在Δ130-136小鼠(间隙连接损伤)中观察到破骨细胞生成和骨折延迟愈合。但在R76W小鼠实验组并没有观察到促进半通道可使骨折延迟愈合恢复。研究结果证实，间隙连接和半通道在骨修复中起着相似的协同作用[16]。

2.2 Cx43与成骨细胞分化及骨形成 最近对老年骨质疏松的研究有了新的进展，Genetos等[17]用PTH分别刺激3组大鼠(分别为幼年、成年、老年)成骨细胞的Cx43进行功能对比，结果提示在幼年组大鼠成骨细胞中Cx43的mRNA和蛋白呈明显过表达，但在成年和老年组大鼠中Cx43的mRNA和蛋白未发生明显改变。根据结果推断，在成骨细胞分化过程中及骨形成过程中，Cx43起着重要作用，由此可推测，Cx43与老年骨质疏松的发生发展有着不可分离的关系。在骨髓中，对于各细胞的分化，Cx43也起到了重要的调控作用。Cx43在骨稳态中起到重要作用，并且Cx43基因(GJA1)突变与眼牙指畸形(ODDD)有关，后者是一种以骨骼异常为特征的人类疾病，成骨细胞中的Cx43是骨骼重塑周期的关键调节剂，它的缺失会引起结构变化，提醒骨骼老化或废弃。

有研究报道，在成骨细胞及骨细胞中缺乏Cx43或仅在骨细胞中缺乏Cx43的小鼠[Cx43(ΔOt)小鼠]中表现出骨细胞凋亡、皮质内吸收和骨膜骨形成增加，导致股骨中段骨髓腔和总组织面积增加。对凋亡骨细胞、骨细胞蛋白表达、再吸收和形成的解剖学研究表明，Cx43通过调节位于皮质特定区域的骨细胞中骨保护素和硬化素水平来控制破骨细胞和成骨细胞的活动。在Cx43(ΔOt)小鼠的皮质骨中，空骨陷窝和缺少骨保护素的活骨细胞分布在整个皮质骨中，凋亡的骨细胞首先发现位于含有破骨细胞的区域内，提示破骨细胞的募集需要来自死亡骨细胞的主动信号[18]。Cx43在体外成骨细胞分化中起重要作用。成骨细胞及骨细胞中靶向缺少Cx43的小鼠显示骨密度和皮质厚度降低。这些研究诠释了Cx43在骨折愈合过程中的新作用，这表明Cx43的缺失可减少骨形成和骨吸收。

2.3 Cx43与骨代谢信号传导 Cx43介导的细胞间隙连接在调节骨细胞功能、骨细胞存活和凋亡、信号转导、机械传导等方面发挥着重要的作用。Cx43 不仅可以作为细胞间隙连接蛋白来发挥作用(Cx43 高表达可激活 MAPK/ErK及PKCδ，促进成骨细胞分化相关基因如 Runx2、Sp7的转录)，而且还可作为半通道从而起到效用(Cx43 半通道与其他蛋白如磷酸酶、整合素等相互作用，使其开放，释放 PGE2，从而活化Wnt/β-catenin信号转导通路，促进β-catenin 的累积，激活成骨分化，增加骨的矿化)[19-21]。Cx43在成骨细胞分化及骨矿化中起关键作用，但是通过Cx43传导的第二信使及这些第二信使的目标，以及其如何调节成骨细胞功能的机制尚不十分清楚。

2.4 Cx43与miRNA靶向调节机制 miRNA通过相关信号通路，调控靶基因的表达，在成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的增殖分化过程中发挥了重要的调控作用，最终影响骨的代谢，有希望成为骨质疏松症临床治疗的下一步治疗靶点[22-24]。最近研究发现，骨质疏松患者外周血液中多种miRNA表达水平较正常人体具有显著差异。研究发现[25-27]，miR-21、miR-23a、miR-24、miR-25、miR-100和miR-125b这6种miRNA在骨质疏松患者的外周血清及骨组织表达显著增高，特别是miR-122-5p、miR-125b-5p和miR-21-5p在骨质疏松骨折患者的外周血清中表达显著增高。杜莉等[28]在探讨miR-125b对人牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨分化的影响实验中，结果表明miR-125b能够靶向降低Cx43基因水平。而在Cx43过表达的PDLSCs中,miR-125b模拟物对PDLSCs成骨分化的作用被反转。得出miR-125b通过靶向下调Cx43而抑制PDLSCs的成骨分化的结论。

前期研究发现，miR-125b在骨质疏松患者外周血及骨组织中表达显著增高[29]。通过BMSC细胞实验验证及双荧光素酶报告实验验证miR-125b靶向调节Cx43抑制成骨细胞的增殖与分化，从而进一步影响骨的沉积，与骨质疏松的发生密切相关。研究miR-125b调控CX-43的分子机制，为骨质疏松发病机制研究提供理论依据。并将进一步研究miR-125b、外泌体与Cx43调节骨稳态的分子机制，为临床治疗骨质疏松提供新的潜在靶点[30]。

2.5 Cx43与机械应力传导 Cx43在骨骼对机械负荷的反应中起着不可或缺的作用。最近研究中[31]，证明了通过后肢悬吊(HLS)进行机械卸载后，成骨细胞/成骨细胞特异性缺乏Cx43(cKO)的小鼠中小梁骨质量和皮质骨形成速率得以保留。最近的研究建立了Cx43的成骨细胞功能调节剂和骨桥反应机械刺激剂。实验证明，靶向抑制Cx43基因条件下，长骨横断面的发育比正常情况大。因此，Cx43在稳态条件下可能通过抑制皮质内骨吸收和骨膜骨形成来响应机械负荷调节皮质骨模型[32-33]。Cx43可能代表了一种新的药理学靶点，可通过调节机械反应性改善皮质骨强度。

骨骼适应机械负荷，促进骨形成和重建。长期以来，骨细胞被认为是静止的旁观者细胞。然而，最近的研究表明，骨细胞在调节骨的各种功能中起着关键作用。骨细胞是骨机械负荷的主要传感器。它们产生调节骨形成和吸收的可溶性因子。骨细胞在骨基质水平上调节局部的矿物质沉积和化学反应，它们也作为内分泌细胞发挥作用，产生靶向肾脏等远端器官来调节磷酸盐的转运[34]。机械负荷影响骨骼结构完整性和骨重建。对骨细胞施加流体剪切应力等机械刺激可激活由多个信号分子介导的级联机械传导。连接蛋白形成的半通道是一种候选的机械传感器。虽然大多数骨细胞参与机械感觉，但骨细胞是主要的机械感觉细胞。骨细胞胞体和突起被充满液体的空间包围，形成一个广泛的空腔小管网络。间质流体的流动是将机械刺激传递给骨细胞的一个主要的应力相关因素。骨细胞的长树突形成一个间隙连接通道网络，不仅连接相邻的骨细胞，而且连接骨表面的细胞，如成骨细胞和破骨细胞。机械敏感性骨细胞也形成半通道，介导细胞内外微环境之间的沟通。Cx43半通道是释放前列腺素的入口，而前列腺素是介导机械负荷对骨形成和重塑生物反应的关键因子。有研究观察到流体流动剪切应力(FFSS)会打开半通道；但是，持续的FFSS会导致半通道关闭，因为持续打开半通道对细胞活性和骨重建不利[35]。骨细胞被认为是骨重建的中心，富含骨细胞的连接蛋白通道可能是影响骨功能的主要因素。

2.6 Cx43与抗骨质疏松药物 在过去几年中，不少实验研究工作已经证明了Cx43在骨细胞对各种刺激反应中的作用。这些半通道在药物和机械刺激下开放。比如，抗骨质疏松药物双膦酸盐对成骨细胞和骨细胞活性的保护依赖于Cx43在体内外的表达，并通过未连接的半通道介导；Cx43半通道也是骨细胞释放前列腺素、ATP及体外机械刺激诱导细胞存活所必需的；此外，它们是甲状旁腺激素抗成骨细胞凋亡作用所必需的[36]。抗骨质疏松药物二膦酸盐对成骨细胞和骨细胞活性的保护依赖于Cx43在体内外的表达。这种效应不需要细胞间的通讯，而是由非对抗性的半通道介导的。体外机械刺激诱导骨细胞释放前列腺素和ATP也需要Cx43半通道。最近的证据显示，Cx43介导的甲状旁腺激素表达也促进更多的甲状旁腺激素表达[37]。越来越多的研究证据表明，Cx43是细胞内机制的关键组成部分，负责在骨骼中对药物、激素和机械刺激进行信号转导。

基于大量研究，连接蛋白通道可能成为治疗骨质疏松症和骨丢失的一个潜在的新靶点。

3 小结及展望

尽管Cx43研究取得了重大进展，但仍有许多工作要做。Cx43传导的骨分解代谢信号的性质、与生物学相关的第二信使仍需要确定。这些研究对于理解Cx43最终如何影响骨骼质量至关重要。从而能够调节依赖Cx43的过程，增加成骨细胞分化及骨量积累，达到预防或治疗骨代谢疾病如骨质疏松症的目的。

了解Cx43是通过什么途径来调节骨组织重塑的，这个机制对骨质疏松等治疗存在指导意义。改变细胞间隙通讯信息或靶向调节间隙连接的信号机制可用于影响骨骼的稳态，从而驱动成骨分化或抑制骨吸收。近几年，研究发现miRNA调节在骨重建中起到不可忽视的作用，而且不少研究证实了miRNA与Cx43之间存在着尚不清楚的分子调节机制。了解这部分调节机制可为骨代谢疾病发病机制研究提供新的思路。