细胞外基质蛋白在种植体表面功能化改性的研究进展*

刘梦园 吴凯敏 王旭东

随着老龄化社会的到来，我们将不得不面临大量的年龄相关性疾病，尤其是牙齿缺失。口腔种植已发展成为牙齿缺失患者治疗的首选。众所周知，良好的骨结合是种植成功的关键。种植体表面特性，包括润湿性、表面化学特性、粗糙度以及表面微形貌，是骨-种植体界面的重要影响因素。对种植体表面进行生物功能化改性以提高骨结合是当前国内外研究的热点［1］。

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是构成细胞外微环境的主要成分，在组织稳态、生长和成熟中发挥着重要作用。同时，在细胞成分与周围微环境相互作用的过程中整合了许多细胞进程，如黏附、生存、迁移、形态、增殖和分化等。在过去的几十年里，ECM有机生物分子越来越多的被用于骨种植体表面有机涂层的构建。通过将有机生物分子加载富集于种植体表面，能够在骨-种植体界面获得诱导特定生物反应的涂层。整合素是细胞黏附受体中的重要成员，是细胞与ECM间黏附识别的关键分子［2］。整合素受体与ECM蛋白的结合可以形成细胞内信号复合物，启动细胞内级联信号反应以控制细胞的增殖和分化［3］。因此，利用来自ECM生物分子对种植材料进行修饰，可以促进整合素介导的成骨细胞黏附，从而改善骨结合。本文将对主要ECM蛋白促成骨作用可能机制及其参与的种植体表面的生物功能化改性做一综述。

1.Ⅰ型胶原

1.1 Ⅰ型胶原促进种植体骨结合的机制Ⅰ型胶原是ECM中最丰富的蛋白质成分，参与了许多生物功能，是成骨细胞功能（黏附、分化和细胞外基质分泌）的中间介质。Ⅰ型胶原可以通过整合素与细胞结合，将细胞外信号传递到细胞内，刺激细胞内信号通路，引导细胞附着、增殖和分化等行为。此外，Ⅰ型胶原还有助于生长因子和细胞因子的保留、局部储存和传递，在器官形成和组织再生中起着关键作用［4］。因此，Ⅰ型胶原被认为是一种经典的种植体表面涂层构建分子［5］。

Ⅰ型胶原促进种植体骨结合的机制可能有以下三点。首先，Ⅰ型胶原可以促进成骨相关细胞在种植体表面黏附，这主要是通过Ⅰ型胶原与细胞表面的整合素β1 通路来提高细胞的黏附能力。其次，研究证明Ⅰ型胶原与细胞表面α2β1整合素相互作用是大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）成骨分化的重要信号，外源性胶原对MSC成骨分化的刺激作用可能是通过胶原分子与MSC或来源于MSC分化细胞的α2β1整合素受体的相互作用实现的［6］。第三，Ⅰ型胶原作为ECM 的组成部分可以促进成骨分化和矿化骨基质的成熟［7］。

1.2 Ⅰ型胶原在种植体表面的应用Ⅰ型胶原在种植体表面的应用方法多样，主要是物理吸附和共价结合两种方式。Schliephake等人采用物理吸附的方法将Ⅰ型胶原吸附于钛种植体表面，发现在胎牛血清存在的情况下，这一涂层可加速成骨细胞的初始黏附，并可增强种植体与骨接触和周围新骨形成［8］。物理吸附技术的缺点是对吸附的生物活性分子的数量和密度控制不佳，而且生物分子可能会从生物材料或界面快速扩散。此外，物理吸附还会导致蛋白质发生构象变化或者变性，从而影响其生物活性。共价结合技术克服了以上的缺点，它不仅可以控制涂层中生物分子的数量，还可以控制生物活性分子在底物界面上的方向。

生物活性分子与钛种植体表面的共价结合的方法相对复杂。它首先需要一个具有活性基团初步功能化的种植体表面，使底物与生物活性分子之间形成稳定的化学结合。在大多数情况下，胶原蛋白可以通过交联剂或电化学沉积的方法与种植体表面进行共价结合。Ao等采用了化学交联的方法将Ⅰ型胶原加载至种植体表面［9］。结果表明，在骨结合中发挥重要作用且具有多向分化潜能的人骨髓间充质干细胞（hMSC）迁移到了Ⅰ型胶原功能化的钛表面孔隙中，这主要归功于Ⅰ型胶原促进了hMSC的附着和迁移。体内结果证实，采用化学交联方法加载了Ⅰ型胶原的种植体表面的骨传导和骨结合更好。这一涂层加快了骨形成和骨细胞长入种植体表面的速度，有望缩短种植体骨结合的时间，减少种植体松动的可能性。在Ao等人另一项研究中，采用了层层自组装的方法将Ⅰ型胶原和透明质酸共同加载至钛种植体表面［10］，这一涂层具有良好的生物学特性，可以促进MSC的附着、扩散、增殖和成骨分化。通过构建家兔股骨髁缺损模型并进行体内研究，也证实了这一涂层能较好地促进种植体周围骨形成和种植体骨结合。此外，实验中采用了两种不同种植体涂层结合方法：第一种方法是涂层的共价结合，第二种方法是通过物理吸附。研究结果表明，共价结合的多层膜结构相对于物理吸附更加稳定，这种涂层对于促进种植体的成骨诱导、骨结合和无菌性松动至关重要［11］。

此外，Bae等人采用hMSC和大鼠体内模型研究了两种不同的Ⅰ型胶原交联方法（戊二醛交联和伽玛辐射交联）［12］。体外试验显示，与戊二醛交联和无涂层的种植体相比，伽玛辐射交联的种植体表面细胞成骨分化和成骨相关基因表达水平最高。体内实验结果显示两种不同交联涂层间的成骨能力无显著差异，但是由于戊二醛和其他与交联反应有关的化学试剂可能具有潜在的细胞毒性，因此伽玛辐射交联相对来说是一种将Ⅰ型胶原加载至钛种植体表面更为安全的方法。

种植成功不仅需要良好的骨结合，还需要覆盖种植体表面的软组织结合。Truc等人优化了Ⅰ型胶原在钛表面的电化学沉积方法，着重研究了Ⅰ型胶原包裹的植入物对小鼠成纤维细胞L929细胞系的体外作用［13］。结果证实这一涂层可以增加细胞的黏附和增殖能力。此外，Ⅰ型胶原也可应用于纳米形态的钛种植体表面，Nojiri等人在天然聚丙烯酰胺凝胶体系中将带负电荷的Ⅰ型胶原c端垂直嫁接于阳极钛纳米管表面，这一涂层促进了上皮细胞的拉伸和片状团块的形成［14］。

2.纤连蛋白

2.1 纤连蛋白促进种植体骨结合的机制 纤连蛋白（fibronectin，FN）是一类高分子量糖蛋白，是ECM主要成分之一，存在于结缔组织、基底膜和细胞外液中，在细胞的黏附过程中发挥重要作用，作为细胞黏附蛋白能够促进细胞活性、初始细胞附着和细胞伸展，并积极参与细胞骨架重组和骨组织形成。

纤连蛋白对于种植体骨结合的促进作用主要有以下几点。首先，纤连蛋白具有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid，RGD）序列，而RGD序列与整合素α5β1结合参与了细胞和ECM蛋白间的黏附。研究表明在钛表面固定RGD肽可以改善成骨细胞黏附、增殖和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，因此纤连蛋白常被用来促进细胞与生物材料之间的黏附。其次，纤连蛋白与整合素α5β1间相互作用可以影响黏着斑激活信号通路，调控细胞内下游转录因子活性，从而影响细胞早期的增殖和分化［15］。此外，研究发现FN中包含钙敏感性的肝素结合区域，利于钛-骨界面的细胞矿化［16］。因此FN已被用于种植体涂层构建，以增加种植体的生物活性，加速骨结合的进程。

2.2 纤连蛋白在种植体表面的应用Kado等人通过化学方法将血浆纤连蛋白（plasma fibronectin，pFN）加载至钛表面［15］。结果显示，附着在pFN功能化钛表面的细胞数量是附着在光滑钛表面的两倍，并且ALP活性以及矿化结节的数目也显著增加。pFN功能化的钛表面加速了hBMSC的附着、伸展和成骨分化，提示FN修饰的钛种植体表面可以促进更快的钛-骨结合。Park等人通过硅烷化的方法将FN加载至微槽钛表面［17］。与未修饰的钛表面相比，FN加载钛表面显著增加了MSC的成骨分化。在21天时，加载FN微槽钛表面MSC的钙沉积浓度大约是无FN加载的微槽钛表面的两倍。FN功能化的表面不仅在体外具有显著的促成骨分化能力，在动物体内同样具有更好的种植体骨结合。Chang［18］等人采用辉光放电等离子体技术（glow discharge plasma，GDP）处理钛表面，并在其上嫁接FN。结果表明，在GDP处理表面添加FN可提高细胞存活率。体内结果证实［19］，在种植体表面加载FN可以提高种植体的稳定性，尤其是在种植后2-4周时，FN涂层组的骨成熟速度更快且周围骨形成更好。另一项体内外研究则证实了FN针对骨质疏松条件同样具有促骨结合能力［20］。Agarwal等人通过物理吸附方法将FN片段FN7-10应用于食人鱼溶液处理不锈钢表面，促进了整合素α5β1依赖的hMSC的黏附和成骨分化。在健康大鼠1个月和3个月时，FN7-10包覆的不锈钢螺钉与未包覆的螺钉相比，骨种植体机械固定率分别提高了30%和45%。尤其是在骨质疏松大鼠体内，与未包覆的螺钉相比，FN7-10涂层在1个月和3个月时骨钉的固定率分别提高了57%和32%。此外，这种涂层制作方法简单，适用于复杂几何形状和结构的种植体，具有一定的临床转化应用潜力。为了进一步分析FN与钛表面间可能的作用机制。Cho等人选用FN来源寡肽F20（ 序列为PHSRNSITGTNLTPGYTITVYAVTGRGD）进行种植体表面处理的研究，并通过在F20两端分别嫁接RGD和PHSRN来提供最佳活性［21］。结果证实，F20涂层促进了ST2细胞的黏附和增殖以及细胞的成骨分化。以上结果表明，FN的表面修饰增加了种植体的稳定性，并能够缩短种植的治疗时间。

同属ECM黏附蛋白的玻连蛋白与FN具有一定的相似性。Felgueiras等人将FN和玻连蛋白分别吸附到苯乙烯磺酸钠修饰的Ti6Al4V表面［22］。结果证实，与单纯嫁接苯乙烯磺酸钠组相比，FN和玻连蛋白进一步增加了材料表面MC3T3-E1细胞的黏附。同时与玻连蛋白相比，FN组的细胞与材料表面结合更加稳固，而且细胞呈多边形，与成骨细胞自然成熟过程相同。这一结果表明FN可能对成骨细胞早期分化的影响较大，具有更高的生物活性。

FN还可以与骨形态发生蛋白等联合应用于种植体的表面修饰［23,24］，表现出更佳的促成骨分化能力［25,26］和种植体骨结合［27］。此外，在羟基磷灰石上形成的FN-磷酸钙复合层也有助于在体外增强hMSCs的扩散和成骨分化，并且在骨质疏松条件下也具有一定的骨诱导能力。Javier等人通过在金属植入体表面构建磷酸钙涂层支架并加载FN作为骨诱导材料，植入骨质疏松大鼠体内并观察到了早期的骨结合，说明这一方法可以加速骨再生过程，利于骨折的早期愈合并减少并发症［28］。

FN不仅利于骨结合，还可以增强牙龈成纤维细胞的附着。在种植体植入手术后，FN通过在结缔组织和上皮之间形成附着促进软组织愈合，可以防止种植体周围的炎症破坏。Jian［29］等人通过将FN共价结合于硅烷化的微槽状钛种植体表面，发现加载FN可以进一步增加微槽钛表面牙龈成纤维细胞的黏附强度，证实了FN涂层可以增强牙龈成纤维细胞在材料表面的黏附、增殖和伸展。

3.层粘连蛋白

3.1 层粘连蛋白的构成 层粘连蛋白（laminin，LN）是一种糖蛋白，是大多数细胞和器官组织（包括大脑、骨骼肌和周围神经）基底层主要结构成分，其呈三聚体结构，有3个链（α、β和γ）形成交叉结构。层粘连蛋白α2链呈现一个大的球状（LG）结构模块，能够结合细胞跨膜分子，包括整合素、多配体聚糖和营养不良聚糖。这种结合特性赋予了LN多种生物活性，包括细胞黏附、分化和迁移、血管生成和肿瘤转移。

3.2 LN-1在种植体表面的应用LN-1，也被称为LN-111，主要在胚胎发育期间表达［30］，可以通过整合素α1、αv、α6和β1调节机制，来增强MSC和祖细胞（BMPCs）中骨钙素（OCN）、osterix（OSX）、CBFA-1、Runx-2、Ⅰ型胶原和ALP的表达［31,32］。体外研究表明，LN-1增加了钛种植表面磷酸钙的沉积［33］。Schwartz-Filho通过将LN-1涂覆于种植体表面，植入兔子胫骨干骺端。结果表明，LN-1可以增加成骨细胞的标志物Runx-2、OCN、ALP和Ⅰ型胶原的表达水平以及种植体的骨结合，尤其是在骨结合的初始阶段［34］。其他体内研究也报道了LN-1涂层可以改善种植体周围的骨结合［32,35］。因此，在临床上，LN-1具有促进种植体与牙槽骨融合的潜力。

3.3 LN-2在种植体表面的应用 由于LN-2来源肽的分子量小、抗原性低，目前已被研究作为新型的治疗药物。并且不同LN异种三聚体和异种异构体对骨结合的影响已被报道，LN-2-P3和LN-2-LG3可增强骨细胞功能，并可在体内加速钛种植体周围的骨结合［36,37］。

3.4 LN-5在种植体表面的应用LN-5，又称为LN-332，广泛分布于上皮组织中，在胚胎早期发育过程中参与组织分区和细胞表型的形成［38］。黏着斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）是由整合素结合到黏着斑位点的ECM所触发的细胞质酪氨酸激酶，细胞外信号相关激酶（extracellular signal-related kinase，ERK）是FAK下游信号靶点［39］。研究证实，LN-5可以通过整合素α3β1/α2β1影响FAK/ERK激活，进而导致Runx-2/CBFA-1 磷酸化和骨桥蛋白（OPN）、OCN、ALP、DSPP和DMP-1的表达［40］。目前的一项研究通过将LN-1和LN-5吸附在铝-氧化锆上，发现这一功能化表面上的细胞活化更好［41］。此外，作为上皮细胞黏附和迁移相关的重要分子，LN-5还被应用于增强种植体表面软组织黏附，以提高种植体的长期稳定性。Werner等通过在多孔钛表面加载LN-5进一步增强了钛种植体软组织结合，可以有效地保护种植体不受其周围炎症的影响［42］。Koidou等人则同时加载了LN-5和成釉蛋白多肽，增加了角化细胞的增殖和半桥粒的形成［43］。双肽涂层有望改善种植体周围黏膜的密封，以满足预防种植体周围炎的迫切需要。

4.弹性蛋白

4.1 弹性蛋白促进种植体骨结合的机制 类弹性蛋白（elastin-like protein, ELP）是一种柔性且生物稳定的合成聚合物。它的结构是基于弹性蛋白原而设计的，弹性蛋白原是弹性蛋白的基本组成部分，而弹性蛋白是生物体内一系列组织中存在的弹性纤维的主要成分［44］。ELP的众多功能之一是形成坚固的水凝胶支架，促进hMSC的生长和骨再生［45］，此外，ELP具有良好的生物安全性并可以大规模生产和纯化，已被广泛应用于药物传递和软组织工程应用。

4.2 ELP在种植体表面的应用Salvagni等人通过有机硅烷化学反应将ELP加载至钛表面，这一涂层可以显著提高hMSCs体外ALP活性［46］。Raphel等人通过共价结合的方式将包含RGD黏附序列的ELP与植入体表面结合［47］，然后将植入体插入模拟骨骼特性的10PCF聚氨酯泡沫中并将植入体压入老鼠的股骨中。通过光交联形成的ELP涂层可以在植入过程中保持完整，这是植入体涂层发挥生物活性功能的关键条件。体外实验显示，与纯钛表面相比，ELP涂层促进了成骨样细胞MG63的黏附。早期ALP活性测定的结果表明，这一涂层也促进了更快的成骨分化和种植体表面的矿物沉积。大鼠股骨和胫骨的体内研究显示，ELP涂层种植体的骨-种植体接触面积和界面强度增加，提示ELP-RGD涂层具有防止种植体无菌性松动的能力。

5.骨涎蛋白

5.1 骨涎蛋白促进种植体骨结合的机制 骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）是ECM中主要的非胶原糖基化磷酸蛋白之一。它是一种矿化组织特异性蛋白，表达于分化的成骨细胞中，并在骨的初始矿化中发挥作用。BSP的成核序列可以帮助无定形磷酸钙团簇成核，最终转化形成羟基磷灰石晶体。而且，BSP具有促进破骨细胞黏附和分化的功能，可通过RGD介导的细胞相互作用促进成骨细胞分化，还可以作为一种基质相关信号直接促进成骨细胞分化，促进矿化基质的生成［48,49］。

5.2 骨涎蛋白在种植体表面的应用Im等学者将BSP共价结合到硅烷化微槽钛植入体表面［50］。与光滑的钛表面相比，钛表面微凹槽增强了MSC的分化和伸展。而BSP涂层则进一步提高了微凹槽种植表面的生物活性，显著增强了细胞的分化和伸展。相比于微凹槽和光滑表面，BSP修饰微凹槽表面的主要成骨转录因子ARF4、FRA1、RUNX2和OSX的表达均升高。Baranowski等人也研究了钛种植体BSP涂层对原代人成骨细胞和L929成纤维细胞的影响［51］。通过硅烷化共价偶联或物理吸附的方式将BSP加载至水虎鱼处理的钛表面，促进了细胞增殖以及RUNX2和骨桥蛋白的表达，此外涂层中BSP浓度的增加可以促进细胞的迁移速度。以上结果表明BSP涂层可以加快种植体骨结合。尽管BSP具有很高的生物学活性，但之前的一项研究发现，FN比BSP表现出了更高的生物相容性，可以更好的促进OSX基因表达［50］。因此，在种植体表面加载BSP时，应该同时考虑FN可能具有更好成骨作用。

6.小结

综上所述，胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和骨涎蛋白等可以通过物理吸附和化学结合等多种方法用于种植体表面改性以促进种植体骨结合，具有很好应用价值。但是，这些生物源性蛋白在实际应用中可能存在以下问题：（1）大多数蛋白质是通过活的有机体或从组织中分离出来重组生产，会导致不同批次间生物活性的差异。（2）细菌内毒素、免疫原性供体材料残留物或非自体ECM成分会带来感染和免疫原性的风险。（3）蛋白质是酶可降解的，不利于长期生物活性的保持，并且蛋白质对pH值、温度和溶剂的变化非常敏感。（4）全长蛋白质的溶解度很低，且大量提取和纯化成本很高。因此，从ECM中获得的特定生物活性序列的人工合成肽越来越多的应用于生物材料的功能化改性，在未来的研究中，应该重点研究如何保持多肽关键位点的活性和特异性。