细胞焦亡的发生机制研究

王 锐，付 萍

（昆明医科大学第二附属医院风湿免疫科，云南 昆明 650000）

细胞死亡组成机体免疫应答的重要部分，是机体的一种保护机制，可以帮助机体清除内源性和外源性伤害，从而维持组织正常机能和形态。细胞死亡的形成和机制是多种多样的，研究者已经逐渐发现了各种细胞死亡模式，例如凋亡，坏死，自噬，胀亡和焦亡[1]。细胞焦亡（pyroptosis）是近年来新发现的一种由半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）介导的程序性细胞死亡。它的特征在于细胞肿胀和破裂，细胞内含物的释放以及强烈的炎症反应。细胞焦亡和各种疾病密切相关。本文综述了细胞焦亡的定义、形态特征、分子机制，以探讨细胞焦亡的调控机制，为治疗细胞焦亡的相关疾病提供新途径。

1 细胞焦亡的定义

细胞焦亡是近年发现并被证实的一种伴随炎症反应的细胞程序性死亡方式，与其他死亡方式不同，主要通过识别微生物和各种内源性危险刺激，炎性caspase-1/4/5/11 被激活，GSDMD 裂解，膜上形成孔隙，细胞肿胀，质膜破裂，伴随释放大量炎症因子，扩大炎症反应的过程[2，3]。Chen Y 等[4]首次报道了存在着caspase-1 依赖性细胞死亡方式。1999 年对沙门杆菌感染的巨噬细胞的研究也表明[5]，活化的caspase-1 可导致一种促炎症形式的调节性细胞死亡，释放大量促炎因子，与caspase-3、caspase-6、caspase-7 的激活无关；接下来，在被李斯特菌、嗜肺军团菌、假结核耶尔森菌、铜绿假单胞菌等多种病原体感染的巨噬细胞中，也发现这种依赖caspase-1 的细胞死亡方式[3]。caspase-1 通过激活白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 的前体，促进IL-1β、IL-18 成熟并产生活性，IL-1β 成熟后参与免疫反应，发挥促炎症介质作用，将固有免疫细胞召募到感染部位和调节适应性免疫细胞，而IL-18 成熟后对于产生干扰素-γ 和增强自然杀伤细胞和T 细胞的溶解活性非常关键[6]。焦亡与凋亡之间的区别之一是诱发炎症，并且焦亡与凋亡和坏死等其他细胞死亡方式在形态、机制和病理生理上也有显著不同。Pyroptosis 一词最早由Brennan MA 等[7]在2001 年提出，来定义这种独特的伴随促炎介质释放的细胞死亡方式。

2 细胞焦亡的特征

常见的细胞死亡分为凋亡和坏死。细胞凋亡是细胞主动有序的死亡过程，而不将细胞内容物释放到细胞外，可有效抑制炎症。坏死由环境破坏引起，是细胞的被动和意外死亡，并导致炎性细胞内容物不受控制的释放。细胞焦亡像细胞凋亡一样，它使细胞自杀，但是两者又具备显著的不同[8]：发生细胞凋亡的是未被病毒和细菌感染的正常细胞，而发生细胞焦亡的是那些被病毒或细菌感染的细胞；从形态学的观点来看，细胞焦亡的明显特征是胞膜完整性的破坏，胞内容物的流出，类似于坏死，但与细胞凋亡不一样，凋亡维持完整的细胞膜，胞质不会外流；形成凋亡与焦亡的机制也不同，胞膜内陷包裹胞内容物，形成凋亡小体，细胞肿胀、胞膜受力不均造成焦亡[8，9]。随着焦亡细胞膨胀，细胞核浓缩，染色质DNA 断裂，TUNEL 染色显示出阳性，这与坏死和凋亡相同。但是细胞焦亡发生时，细胞膜上会形成小孔，使细胞膜的结构完整性破坏，膜内外的离子失去平衡，细胞内渗透压升高，水从孔隙中流入，细胞发生肿胀，细胞膜破裂，同时大量促炎因子，如IL-1β和IL-18 等细胞内容物大量渗出，使周围更多的炎症细胞募集，导致一系列炎症反应诱发[1]。发生焦亡的细胞膜迅速的破裂，伴随释放细胞内容物和促炎介质，明显不同于凋亡及坏死。简而言之，细胞焦亡是凋亡和坏死结合的一种新型细胞死亡方式。

3 细胞焦亡通路中的主要蛋白

3.1 炎性小体 炎性小体是一种多聚蛋白复合物，迄今为止，已有NOD 样受体（NLRs），如NLRP1、NLRP3、NLRC4，AIM2 样受体（ALR）和TRIM 家族成员Pyrin 等主要成员，在炎症反应发生和维持中起关键作用[10]。在这些炎性体，NLRP3 炎性体被广泛研究，因为NLRP3 炎性体失调可能会导致先天和获得性炎症疾病的发生发展[11，12]。NLRP3 属于NLR 蛋白家族，广泛存在于多种免疫细胞和非免疫细胞中，在人类中包括22 个成员，在小鼠中至少有34 个成员。活化后，NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）及caspase-1 前体会聚集成一种多聚蛋白，称为NLRP3 炎性小体。主要包含3 部分：羧基端含有亮氨酸重复序列，中段为核苷酸结合和寡聚化结构域，氨基端为caspase 激活和募集域（CARD）或热蛋白结构域（PYD）；C 端被认为与识别刺激有关，用于配体感应和自身调节，中段是炎性体的核心部分，介导NLR寡聚化，N 端介导下游蛋白-蛋白质相互作用[13，14]。信号传输由PYD 和CARD 组成的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）适配器衔接[15]。多种刺激物作为病原体相关分子模式和危险相关信号模式，使NLRP3 与ASC结合，招募无活性的前体caspase-1 形成NLRP3 炎性体，使caspase-1 活化，诱导促炎因子释放，发生细胞焦亡[16]。NLRP3 炎性体能被一系列激动剂激活，包括ATP、细菌毒素、微生物产物、核酸、透明质酸，以及真菌、细菌和病毒病原体[17]。随后研究中发现，大多数微生物刺激物，如Toll 样受体（TLR）配体和胞壁酰二肽，不是直接激活NLRP3 炎性体，而是通过结合引发NLRP3 炎性体激活[18]。NLRP1 炎症小体只能识别炭疽致死毒素和胞壁酰二肽。NLRC4 炎症小体仅由鞭毛蛋白和细胞壁酰二肽等PAMPs 激活。AIM2 属于具有200 个氨基酸重复序列（HIN-200）的造血干扰素诱导性核蛋白[19]。ALR 家族的成员是I型IFN 诱导型蛋白，并且ALR 家族基因的数量在物种之间有所不同。人类中有4 个ALR 家族基因（AIM2，IFI16，PYHIN1 和MNDA），小鼠中有13 个基因（包括AIM2 和IFI202）[20]。AIM2 最初是从人黑素瘤细胞中分离出来的[19]。人AIM2 由1 个HIN-200域的C 端和1 个PYD 的N 端组成。正常情况下，AIM2 的pyrin 和HIN-200 结构域形成分子内复合物并保持自抑制状态。感染后，C 末端的HIN-200 结构域与双链DNA 直接结合。AIM2 通过PYD 与ASC进行连接。在AIM2 的C 端HIN-200 结构域中存在两个相邻的寡核苷酸/寡糖的结合[21]。AIM2 在细胞焦亡中的主要作用是识别病原体释放的双链DNA，然后与ASC 和Pro-caspase-1 组装形成AIM2 炎性体。AIM2 沿着DNA 的长链寡聚化，帮助宿主防御细菌和病毒病原体[22]。AIM2 不仅识别由细菌破裂释放的DNA，而且识别由病原体宿主细胞释放的DNA。因此，AIM2 对外源DNA 和内源DNA 都有反应[23]。炎性小体与多种炎症疾病的发生发展密切相关，虽然目前研究很多，但其详细的活化机制仍不清楚。

3.2 Caspase 家族 炎性半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase）是一类进化相对保守的细胞内蛋白酶家族，主要参与细胞死亡和炎症反应。Caspases 不参与其他程序性细胞死亡，只在启动细胞凋亡和焦亡中起重要作用[15]，参与细胞凋亡的半胱天冬氨酸蛋白酶（caspase-2/3/6/7/8/9/10）相关研究较多，caspase-3是凋亡的主要执行者；而人鼠共有的caspase-1（人类caspase-4/5 及鼠类caspase-11）近年来被发现是一类炎症性caspase，与细胞焦亡有关。炎性小体通过各种内源性和外源性信号刺激激活caspase，活化的caspase 可快速形成直径为1.1～2.4 nm 的质膜孔，乳酸脱氢酶等胞内物质从细胞内流出，细胞渗透压改变从而肿胀破裂，细胞膜完整性的丧失使炎症介质释放到细胞外环境，进而放大局部和全身炎症反应，这是细胞焦亡发生的主要机制[24]。有研究显示[3]，多蛋白复合物炎性小体介导caspase-1 的活化，炎性小体活化后，将caspase-1 前体分别裂解成为p10、p20 两个亚单位，caspase-1 p20 介导前体IL-1β 和IL-18 的成熟，成熟的IL-1β 和IL-18 分泌到胞外，导致细胞焦亡[25]。虽然caspase 家族的成员在氨基酸结构和序列上相似，但其生理作用上却有很大差别，参与细胞焦亡的主要是caspase-1/4/5/11。

3.3 执行蛋白GSDMD GSDMD 是一种含有Gasdermin 结构域的打孔蛋白，大小约为53 ku。GSDMD 不能被凋亡相关的caspase3/7/8 切割，而炎性caspase1/4/5/11 能促进GSDMD 的激活和N 端裂解释放。未受刺激时，其活性功能因C 端与N 端结合而被抑制，因此全长GSDMD 是不活跃的。GSDMD 被活化后的炎性caspase 切割后，形成两个结构域，22 ku 的C 端和31 ku 的N 端[26]。活化后的GSDMD-N端片段易位至细胞膜，通过特异性结合细胞膜上磷酸化磷脂酰肌醇，发生寡聚化，在细胞膜上打孔，形成孔道，可以允许IL-1β 和IL-18 以及其他细胞内容物通过该孔道，渗透压改变，促进水分内流，引起局部细胞肿胀，使细胞膜裂解[27]，进一步诱导细胞焦亡。由此可知，只有N 端被激活后才能发生细胞焦亡。有文献报道[28]，GSDMA3 和GSDMA 的N 端与GSDMD 的N 端相似，同样可以结合脂质，参与孔隙形成，进而破坏细胞膜完整性。这可能提示Gasdermin 家族的蛋白有相似的成孔活性从而执行细胞焦亡，将来可以定义为Gasdermin 介导的程序性细胞死亡[29]。GSDMD 是导致细胞焦亡的关键蛋白，也是主要执行者，通过活化后的N 端在细胞膜上打孔引发细胞焦亡。

4 细胞焦亡的信号机制

根据细胞受到的刺激不同可诱发的不同的细胞焦亡途径，人和鼠都存在经典途径和非经典途径这两种方式的细胞焦亡，经典炎性小体途径依赖于caspase-1 的活化，非经典炎性小体途径是由于小鼠caspase-11 活化以及人类的caspase-4 和caspase-5活化引起的[15]。序列分析表明，人caspase-1 和鼠caspase-1 是直系同源物，而人caspase-4 和5 起源于小鼠caspase-11，因此，鼠caspase-11 与人类细胞中的caspase-4 和caspase-5 有同样的功能。细胞焦亡中的炎症性caspase 被炎性体激活。经典途径中，一系列微生物刺激和内源性危险信号被不同的细胞质传感器蛋白检测到，这些蛋白通过衔接蛋白招募前caspase-1 单体，并通过二聚体活化caspase-1，介导细胞焦亡[30]。非经典途径中，细菌脂多糖可以直接被caspase-4，caspase-5 和caspase-11 识别[31]，结合后可以触发caspase-11 的寡聚化和活化，切割GSDMD，GSDMD-N 结构域在脂质膜上形成孔并通过细胞膜破坏引发细胞焦亡，导致疾病发生发展。但脂多糖如何特异性结合caspase-11，人caspase-4 和caspase-5 的CARD 结构域，而不是其他caspase 的CARD 结构域目前尚不清楚。

5 总结

细胞焦亡是一种依赖炎性caspase 的细胞死亡类型，其特征是膜孔形成、细胞肿胀、质膜破裂和细胞内物质释放。caspase-1/4/5/11 参与细胞焦亡，并被各种入侵病原体和内源性刺激等特异性炎性小体激活。炎性小体直接激活caspase-1，caspase-1 裂解GSDMD 并激活proIL-1β 和proIL-18，通过经典细胞焦亡信号途径将IL-1β 和IL-18 从细胞质分泌到外界环境。在非经典途径中，caspase-11/4/5 识别并结合细菌脂多糖，导致GSDMD 裂解和炎性物质释放，引发细胞焦亡。细胞焦亡广泛参与到各种疾病中，且发挥重要作用。细胞焦亡是一把双刃剑，适度的细胞焦亡有助于细胞内环境的稳定，可以有效防止细胞过度增殖，从而保护宿主。但是在某些条件下激活过度，不仅不能控制炎症反应，反而引起相关疾病，甚至威胁到生命。目前针对细胞焦亡的研究有限，还需要深入探索许多机制。所以，加深了解细胞焦亡的分子机制可以帮助我们解释其在疾病中的作用以及如何将这些机制转化为治疗产生长期影响。