细胞焦亡在脓毒症肝损伤中的分子机制和研究进展

郭笑潇 陈明泉

脓毒症(Sepsis)是机体抗感染反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍[1]，临床表现复杂，其发病率和病死率居高不下。肝脏作为人体最大的腺器官，血运丰富，参与维持代谢和免疫稳态，但也是脓毒症最常受累的器官之一[2]。肝损伤能够影响机体对细菌或脂多糖(LPS)的清除能力，是多器官衰竭和死亡的独立预测因素，需尽早发现及干预[3]。

细胞焦亡(Pyroptosis)是一种细胞自发的程序性死亡，协助固有免疫系统清除病原体，同时激活强烈的炎性反应[4]。已有研究表明，焦亡在调节脓毒症的发展和预后中起重要作用[5]，焦亡的适度激活有助于及时清除感染细胞，但过强的反应会造成大量细胞死亡、器官损伤甚至衰竭。

目前，细胞焦亡在脓毒症肝损伤中的作用机制尚不明晰。因此，本文总结了近年来细胞焦亡分子机制的研究进展，以及焦亡在脓毒症肝损伤中起到的作用，旨在为脓毒症肝损伤的临床诊治提供新思路。

一、细胞焦亡的概念与分子机制

与凋亡相似，焦亡也依赖程序性死亡关键蛋白半胱氨酸-天冬氨酸水解酶(Caspase，又称胱天蛋白酶)，产生细胞核固缩和DNA断裂。不同的是，焦亡依赖Caspase-1/4/5/11，下游事件由打孔蛋白消皮素(Gasdermin)家族蛋白执行，特征表现为细胞肿胀、胞膜微孔形成、细胞破裂和胞内容物释放，膜联蛋白V(Annexin V)染色阳性，TUNEL染色结果较凋亡细胞浅[6]。焦亡的激活途径主要分为依赖Caspase-1的经典途径和不依赖Caspase-1的非经典途径。非经典途径在人类中由Caspase4/5介导，在啮齿动物中由Caspase-11介导。

(一) 经典途径 细胞焦亡经典途径的启动需要胞内多聚蛋白复合物炎症小体(Inflammasome)参与识别多种炎症激活因子。当机体遭受病原体、毒素等刺激时，胞膜上的模式识别受体(PRR)识别PAMPs或DAMPs，启动下游炎症小体合成。炎症小体复合物包含受体蛋白、Caspase前体和含有Caspase蛋白活化和募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)。目前已知参与形成炎症小体的受体蛋白有：含pyrin结构域NOD样受体家族1(NLR family pyrin domain containing 1，NLRP1)、NLRP3、含CARD结构域NOD样受体家族4(NLRC4)、黑素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma 2，AIM2)和Pyrin蛋白等[7]。这些受体蛋白均通过死亡折叠域(Death fold domains)PYD或CARD募集接头蛋白ASC放大信号后，与Caspase蛋白前体结合，组成炎症小体[8]。

NLRP3是目前研究最广泛及深入的炎症小体，能够接受病原体、毒素、细胞损伤释放的DAMPs等多种刺激信号的激活。NLRP3活化需要双信号介导——启动信号与活化信号。启动信号(Priming signal，signal 1)由胞外的PAMPs或细胞因子与细胞膜上的PRR结合发起，上调细胞核NLRP3、白介素(Interleukin，IL)-1β前体和Caspase-1蛋白转录水平。活化信号(Activation signal，signal 2)由未活化的NLRP3单体识别PAMPs和DAMPs发起，激活NLRP3单体发生寡聚并通过PYD招募集结ASC，进而诱导ASC的CARD域募集Pro-caspase-1，组成完整的NLRP3炎症小体[9]。在病原体感染时，炎症小体激活的Caspase-1剪切IL-1β、IL-18前体并切割Gasdermin D(GSDMD)蛋白N端。成熟的IL-1β和IL-18释放至胞外增强炎症反应并趋化更多固有或适应性免疫细胞，活化的GSDMD转位至细胞膜磷脂层，形成孔洞，造成胞外钠离子、钙离子内流，破坏了胞内外渗透压，最终导致细胞吸水肿胀，胞膜破裂并释放胞内容物[10]。因此，炎症小体能引发强烈的炎症反应并介导细胞焦亡，在脓毒症中起重要作用。

(二) 非经典途径 脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌细胞壁的重要组成成分，致病菌中的LPS是导致脓毒症的重要原因。已有研究发现，LPS与TLR4结合后激活MyD88/TRIF/NF-κB和IFNR/JAK/STAT通路促进Caspase-4/5/11水解活化，通过非经典途径剪切GSDMD启动焦亡[11]。同时，活化的GSDMD也可在胞内直接促进NLRP3小体中Caspase-1激活，协同启动焦亡的经典途径[12]。然而，非经典途径的焦亡还存在其他可能的机制，LPS可不依赖TLR4受体激活Caspase-11，但具体的受体及通路仍在研究中[13]。

二、焦亡通路在肝损伤微环境中的作用

肝脏是抵抗病原体血流入侵的重要防线，已有研究表明，肝细胞、库普弗细胞、星状细胞等均存在焦亡反应通路，可通过识别PAMPs或DAMPs启动细胞焦亡，或通过细胞间交联参与肝损伤。

(一) 肝细胞 肝细胞中炎症小体激活和焦亡对于肝损伤的作用不容小觑。一项近期的研究中，Li等[14]发现了在脓毒症急性肝损伤患者中焦亡通路相关蛋白显著上调，而敲除GSDMD的小鼠肝损伤减少且生存率得到明显提高。

动物感染模型为研究肝细胞焦亡通路在脓毒症肝损伤的作用提供了依据。在盲肠结扎穿孔术(CLP)诱导的小鼠脓毒症模型中，肝细胞焦亡相关蛋白Caspase-1和NLRP3表达增加，且与肝损伤程度正相关，而体外提前给予NLRP3或Caspase-1抑制剂能有效减少LPS对肝细胞造成的损伤[15]。大肠杆菌血流感染模型中，敲除NLRP3的小鼠生存率较野生型高，组织炎症细胞浸润更少，而NLRP3促进播散性细菌感染的病死率不依赖IL-1β和IL-18。作者认为，NLRP3的过度激活可能通过焦亡途径释放内花生酸(Eicosanoid)，最终导致脓毒症加重[16]。除经典途径外，感染后的肝细胞也可发挥细胞交联作用，协助LPS通过非经典途径激活巨噬细胞和内皮细胞的Caspase-11。肝细胞释放的高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)可以在胞外与LPS结合，通过晚期糖基化终产物受体(Receptor for advanced glycation end-products，RAGE)内吞入巨噬细胞或内皮细胞中的溶酶体。HMGB1溶解溶酶体的磷脂双分子层，协助LPS释放至胞内，激活caspase-11和下游的焦亡[17]。

(二) 库普弗细胞 库普弗细胞(Kupffer cell)指位于肝脏中的特殊巨噬细胞，具备自我更新能力，通过吞噬清除内毒素和释放炎症因子维持肝脏中的免疫稳态，是肝脏微环境中主要的免疫细胞，也是肝脏中IL-1β、IL-18和NLRs的重要来源[18]。体内外研究表明，LPS诱导的脓毒症模型中库普弗细胞NLRP3和IL-1β表达量显著上调，提示库普弗细胞具有较强的焦亡通路反应能力[19]。同时，Chen等[20]的研究发现，大量LPS可以导致库普弗细胞释放组织蛋白酶B，促进Caspase-11介导的非经典途径炎症小体激活与细胞焦亡，降低小鼠生存率。

(三) 肝星状细胞 肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)是位于肝脏窦周间隙的内皮周细胞，肝损伤时活化为肌成纤维细胞并分泌细胞外基质参与损伤后修复，同时HSC的激活也是肝纤维化发生、发展的中心环节[21]。已有研究发现，脓毒症患者长期肝硬化的风险增加，且与不良预后相关[22]。小鼠模型中也观察到，脓毒症会增加慢性肝硬化风险[23]，HSC中的炎症小体激活后能够上调结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制剂1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1，TIMP1)表达，增加肝组织中胶原蛋白沉积和肝纤维化[24]。

三、针对焦亡肝损伤的靶向治疗

目前临床上针对脓毒症肝损伤以支持性治疗为主，尚无特效方法。脓毒症中细胞焦亡的过度激活与不良预后相关，许多靶向肝脏内细胞焦亡的体内外实验正在进行当中，显示出了应用前景。

生物制剂因其较好的靶向性和安全性，近年来得到了广泛使用，许多研究发现其在缓解脓毒症肝细胞焦亡中也显示出了一定效果。谷氨酰胺(Glutamine)是体内含量丰富的游离氨基酸，有抗炎和免疫调节功能。Pai等实验表明[25]，给小鼠预防性补充含有谷氨酰胺的饮食能够减少脓毒症72 h后肝脏内的细胞焦亡，减轻器官功能障碍和损伤，提示谷氨酰胺预防性使用可能对脓毒症高危患者有器官保护作用。雌激素在体内兼具抗炎和抗氧化的作用，而肝脏中焦亡信号显示与雌激素存在相关性。雌激素可以降低脓毒症小鼠血清AST、ALT水平，减轻肝脏中线粒体超氧化反应，降低NLRP3-Caspase-1-GSDMD通路表达，从而减轻肝脏的炎症损伤[26]。类似地，促红细胞生成素也可通过抑制NLRP3信号减轻LPS脓毒症大鼠肝细胞线粒体受损和肝损伤[27]。

一些体内新发现的分子或蛋白质显示出了调节细胞焦亡的作用。STAT蛋白是调节细胞增殖、分化和死亡的胞内信号分子和转录蛋白。Wang等[28]研究发现，STAT5a蛋白能够阻断库普弗细胞NF-κB通路，下调Nlrp3基因表达并减少细胞焦亡，为机体抵抗脓毒症提供保护。热休克蛋白A12A(HSPA12A)是热休克蛋白70家族的成员，能够在非酒精性脂肪性肝病中调节肝脏稳态。Liu等[29]研究表明，脓毒症时HSPA12A能够进入肝细胞核，通过PGC-1α上调AOAH蛋白，抑制LPS激活Caspase-11介导的肝细胞焦亡，保护肝损伤。非编码RNA为人类和小鼠基因组重要的转录产物，且参与调节多种生理和病理过程。

多种中草药成分因其抗炎功效而在调节脓毒症肝损伤中表现出良好的效果。野黄芩苷(Scutellarin)是从黄芩中分离出的黄酮类物质，能抑制大肠杆菌感染小鼠巨噬细胞中NLRP3激活与细胞焦亡，减少肝脏中炎症细胞浸润和IL-1β水平[30]。6-姜酚是生姜中具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和神经保护功能的化学物质，能够抑制NLRP3介导的IL-1β分泌，Hong等的研究发现，6-姜酚能在体内外激活Nrf2/HO-1通路抑制巨噬细胞炎症小体激活，阻碍焦亡通路，减轻肝损伤[31]。

四、总结与展望

脓毒症仍是临床上棘手的疑难重症，肝损伤是多器官衰竭和死亡的独立预测因素，但有时临床医生会忽视其对于预后的重要性。细胞焦亡的过度激活会造成大量细胞死亡并促进肝损伤甚至衰竭，靶向焦亡的研究正逐渐增多，但仍存在许多未知。例如，目前人们对于焦亡在肝损伤中的研究以基础研究为主，多集中于炎症小体和Caspase，而对于下游效应分子打孔蛋白的探索较少，细胞焦亡在肝损伤中的信号通路也有待进一步探索；且脓毒症肝脏中焦亡信号的临床证据尚不充足，靶向焦亡的治疗研究不够深入，现有的体内外研究与临床应用仍有较长距离。因此，未来应进一步深入研究脓毒症肝损伤的发病机制，开发针对焦亡的治疗方法，以期降低脓毒症病死率。