乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA形成机制的研究进展

毛天皓 刘天旭 鲁凤民

乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是我国慢性病毒性肝炎、肝硬化及相关肝癌的主要致病因素，我国77%的肝硬化和84%的肝细胞癌 (HCC)与之有关[1]。抗病毒治疗可明显减缓慢性乙型肝炎(CHB)的疾病进展，使我国近年来HBV相关肝硬化和肝纤维化的死亡率有所下降，但HBV相关肝癌的死亡率并未有明显改变[2]。已有足够的证据表明，慢性乙型肝炎的临床治愈可以进一步减少肝癌的发生。因此，慢性乙型肝炎患者的临床治愈已成为医生和患者的共同诉求。

一、共价闭合环状DNA(cccDNA)清除是乙型肝炎治愈的关键

感染肝细胞核内以微小染色体的形式存在的cccDNA是HBV复制的模板，平均每个细胞内的cccDNA拷贝数在5～50[3]。其来源有从头感染(de novo infection)和内补充(intracellular recycling)两个途径。新感染的病毒颗粒核衣壳内部分双链松弛环状DNA(rcDNA)进入细胞核，经宿主DNA修复系统转换为cccDNA；而在已建立感染的肝细胞，cccDNA转录产生的前基因组RNA(pgRNA)在核衣壳内经逆转录合成出rcDNA，这些新合成的rcDNA除了能够以Dane颗粒的形式释放去感染新的肝细胞外，也可以返回核内补充cccDNA池[4]。由于以微小染色体形式存在的cccDNA缺乏着丝粒，在炎症或免疫调节治疗过程中，感染肝细胞的死亡和残存感染肝细胞的代偿性增殖均会导致cccDNA池因丢失而被稀释[5]。

现阶段的药物包括长效干扰素-α(IFN-α)和核苷(酸)类似物(NAs)两种，都不能直接靶向cccDNA。前者具有免疫调节作用，而NAs则通过与天然核苷酸dNTP竞争，掺入病毒DNA新链并不可逆地终止其延伸，使产生的缺陷型病毒颗粒失去感染性[6]。孙剑等[7]通过抗病毒治疗过程中血清HBV RNA耐药突变准种的动态变化，推测cccDNA的半衰期约6个月。这为我们通过影响从头感染和内补充两条途径以耗竭cccDNA提供了可能，但这往往需要长时间的抗病毒治疗。因此，了解HBV cccDNA的形成过程以及宿主细胞影响cccDNA合成的分子机制，对于研发新药、治愈乙型肝炎至关重要。

二、HBV通过从头感染使其基因组rcDNA入核转换为cccDNA

在感染过程中，病毒包膜蛋白乙型肝炎表面抗原(HBsAg)与硫酸肝素乙酰蛋白多糖(HSPGs)以低亲和力结合于肝细胞膜上[8]，进而与肝细胞基底外侧膜上的钠离子-牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)结合[9]，使病毒被内吞进入细胞并被包入内体。病毒包膜随即与内体膜融合释放出核衣壳。后者被运输至核孔复合体中并发生解体，其中的rcDNA与部分核心蛋白(core protein, HBc)进入胞核[10]。

进入细胞核内的rcDNA转化为cccDNA的过程主要包括正链5′末端RNA引物的去除、正链的补全、负链5′末端P蛋白(polymerase)和冗余片段“r序列”的去除。最终，正负链末端分别连接形成cccDNA，并随即发生染色质化成游离的微小染色体结构[11]。在这一过程中，正链5′末端加帽的18个核苷酸(nucleotide，nt)的RNA寡聚引物和负链5′末端约10 nt的冗余片段“r序列”所形成的襟翼结构主要由片段结构特异内切核酸酶1(FEN-1)等宿主因子移除[4]。而不完整的HBV DNA正链则可能被P蛋白和宿主细胞DNA聚合酶κ(POLK)、L(POLL)和H(POLH)延伸补齐[12]。

近期，魏磊等[13]利用酵母和人肝癌细胞提取物的生化合成体系，证明DNA滞后链(正链)合成和cccDNA形成的5种最基本蛋白质原件：增殖细胞核抗原(PCNA)、复制因子C(RFC)、DNA聚合酶δ(POL δ)、FEN-1和DNA连接酶1(LIG1)。但肝细胞内的cccDNA合成机制可能更为复杂，需要细胞DNA拓扑异构酶(TOP)[14]、DNA损伤反应系统ATR-CHK1途径[15]的参与等。

三、rcDNA的形成与cccDNA的内补充

作为病毒RNA生成的模板，cccDNA可转录产生3.5、2.4、2.1和0.7 kb的HBV RNA。其中3.5 kb的前基因组RNA(pgRNA)既是翻译成核心蛋白和P蛋白的mRNA，其本身也是病毒逆转录复制合成rcDNA负链的模板[4]。以pgRNA为模板逆转录合成rcDNA的过程需要经过三次模板跳转。

起初，P蛋白识别pgRNA 5′末端附近的epsilon(ε)茎环，形成P-ε核糖核蛋白(RNP)复合物，被核心蛋白二聚体识别和包装，形成核心颗粒并在其中启动逆转录[16]。在伴侣蛋白的帮助下，P蛋白末端蛋白(TP)结构域中的酪氨酸从pgRNA近5′末端ε茎环的凸起区起始，以碱基配对的原则共价连接3～4 个核苷酸[(T)GAA]，并作为第一个模板引物从pgRNA 近5′末端ε茎环跳转至近3′末端的11 nt直接重复序列1(DR1)处[4]。接着，在P蛋白逆转录酶的作用下进行逆转录，将DNA负链延伸至pgRNA的5′末端，并使负链DNA 3′末端形成冗余片段。与此同时，P蛋白的RNase H结构域也同步介导了pgRNA的降解，而pgRNA 5′末端加帽且包含上游DR1的部分序列在DNA负链合成终止时得到保留[17]。这段未降解的序列从新合成DNA负链近3′末端的DR1跳转到负链近5′末端的DR2，作为第二个模板引物引导DNA正链合成[18]。在第二次跳转成功的基础上，DNA正链延伸至DNA负链的5′末端，新合成DNA正链的3′游离末端从负链的5′末端通过同源互补跳转至负链的3′末端，继续正链DNA的合成并形成rcDNA[19]。目前，我们实验室正在对这些精确跳转的分子机制进行探究。含有rcDNA的核衣壳(nucleocapsid)被病毒包膜糖蛋白包裹形成子代病毒，部分核衣壳也可穿梭回细胞核并继续转化为cccDNA，保持cccDNA池的相对稳定，此即为cccDNA的内补充机制。若第二次跳转失败，则在负链的3′端原位合成正链DNA，形成双链线性DNA(double-strand linear DNA, dslDNA)。dslDNA的发生频率约为rcDNA的5%～20%，主要整合到宿主基因组并能够转录表达HBsAg[4]。

四、cccDNA微小染色体与宿主的相互作用

cccDNA形成后发生超螺旋，并被宿主蛋白(如组蛋白H3和H4)以及病毒蛋白(HBx和HBc)修饰，形成串珠样核小体结构，以游离的微小染色体形式存在。这一结构与宿主正常染色质存在着一定的相似性，具有逃避免疫系统攻击的潜力。但cccDNA微小染色体的核小体间隔(重复长度)为180 bp，与真核细胞染色体200 bp的核小体间隔不同[20]。此外，cccDNA无法进行半保留复制，因此在细胞周期过程中的表现与宿主DNA不同。

cccDNA微小染色体受到多种宿主转录调节因子、共刺激因子和病毒蛋白等单独或联合的调控，展现出与宿主相互作用的广阔图景。肝细胞核因子1/3/4(hepatocyte nuclear factors 1/3/4, HNF 1/3/4)、CCAAT增强子结合蛋白(C/EBP)等宿主因子可能促进cccDNA转录活性；染色体结构维持复合物5/6(SMC 5/6)、转化生长因子β(TGF-β)[21]等被发现可以抑制cccDNA活性。HBx蛋白可以调节多种限制性因子，减弱其抑制作用[22]。我们曾发现HBx可与阴阳1(YY1)蛋白协同介导cccDNA与宿主染色质19p13.11增强子的空间互作，激活HBV转录[23]。HBV包膜蛋白也被证明能够调节cccDNA的形成[24]。cccDNA微小染色体同样可以发生DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传修饰，以调节病毒基因表达和病毒复制[25]。cccDNA包含3个可能被甲基化的CpG岛，在慢性HBV感染患者体内存在不同程度的甲基化[26-27]。DNA甲基转移酶(DNMT)介导了病毒基因组的甲基化，可在体外抑制cccDNA转录及HBV复制[28]。此外，组蛋白甲基转移酶及去甲基化酶、组蛋白乙酰转移酶及去乙酰化酶均参与了对cccDNA微小染色体的组蛋白修饰[25]。黄爱龙等[29]研究表明，组蛋白去乙酰化酶SIRT3可结合至cccDNA微小染色体并协同组蛋白甲基转移酶抑制病毒复制。Yang等[30]对感染HBV的HepG2-NTCP细胞进行3C高通量全基因组易位测序(3C-HTGTS)，发现cccDNA更倾向存在于宿主基因组中富含H3K4me3、H3K9ac、H3K4me1和H3K27ac等组蛋白修饰的活跃增强子和启动子区域。

近年来，对cccDNA的研究日渐深入，但仍然存在许多未知。cccDNA微小染色体的形成过程与宿主细胞分子机制息息相关，体现出病毒感染的复杂性。通过染色质免疫共沉淀(ChIP)等技术，可以对cccDNA结合蛋白进行精细的分析，为静默或清除cccDNA提供思路。CRISPR/Cas9等基因编辑工具已被证明可以靶向编辑和降解HBV cccDNA[31]。硫酸葡聚糖钠(dextran sodium sulfate, DSS)等小分子也或许可以阻止rcDNA转化为cccDNA[32]。随着有效治疗方法的介入，结合cccDNA较短的半衰期，有望在未来实现cccDNA的静默和清除，实现慢性乙型肝炎的临床治愈。