外泌体在肝病诊断中的作用研究进展

刘伟 江梅 邵勇

外泌体最初是从体外培养的羊网织红细胞的上清液中发现的，直径30～150 nm，密度为1.10～1.18 g/mL的囊泡样小体。研究表明，含有多种蛋白质、mRNA及miRNA各种脂类 ,可作为信息传递的载体 ,参与体内多种生命活动过程，成为细胞交流的一种新的方式[1]。外泌体因其独特的有脂质双分层膜结构[2]，能在长期极低的温度下维持稳定状态保护生物学特性，故用来研究多种疾病的病理生理、诊断、治疗及预后。

肝脏作为人体最重要的器官之一，多种肝脏细胞均可以分泌外泌体，或做为外泌体的靶细胞，如肝细胞、胆管上皮细胞、肝星状细胞(HSC)、单核巨噬细胞、自然杀伤T 淋巴细胞及淋巴细胞等，不同细胞分泌的外泌体有着不同的功能。外泌体参与肝癌、病毒性肝炎、肝纤维化、酒精性及非酒精性脂肪肝等疾病的发生发展，研究发现越来越多的外泌体蛋白及miRNAs是多种疾病的潜在生物标志物。本综述总结了近年来外泌体在肝病诊断中的作用研究进展。

一、肝细胞癌(HCC)

肝细胞癌是指由肝细胞发生的恶性肿瘤，是原发性肝癌最常见的病理类型。肿瘤来源外泌体是癌症特定信号的重要载体，并影响肿瘤生长和转移。Sohn等[3]报道分析了慢性乙型肝炎(CHB )、肝硬化(LC)和 HCC患者血清分离的外泌体差异，HCC患者的血清外泌体miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224水平明显高于CHB或LC患者；HCC患者的血清外泌体miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195水平低于CHB患者。Wang等[4]研究比较30例HCC患者和30例慢性乙型肝炎病毒 (HBV ) 感染患者，HCC患者的血清外泌体含有更高水平的miR-21。 Liu等[5]比较了HCC患者与健康个体，miR-122在HCC患者中表达较低，miR-21在HCC患者中较高。目前研究发现，肝癌中miRNA-122表达降低，miRNA-21则升高，提示这两者作为肝癌诊断的标志物的可能性，miR-122可抑制肝肿瘤的生长，这与Wu等[6]的发现一致，在体外，敲除miR-122后抑制肿瘤细胞凋亡，上调HCC细胞活力，提示miR-122有可能作为监测HCC治疗效果的指标。

Sugimach等[7]发现肝细胞癌复发患者外泌体中miR-718显著下降，提示miR-718可以作为判断肝癌复发以及判断肝癌治疗的预后的候选标志物；Liu等[8]发现血清外泌体中的miR-125b可作为肝癌预后指标，血清外泌体miR-125b水平低的肝癌患者复发时间缩短，生存率低，他还发现外泌体miRNA (miRNA-10b, miRNA-21, miRNA-122, miRNA-200a)可能用于HCC早期阶段(肝硬化)的诊断和预测，miRNA-10b在HCC发展的早期阶段，表达显著增加。在ROC曲线中，miRNA-10b预测肝硬化具有非常高的灵敏度；miRNA-21比miRNA-10b的特异性低；miRNA-122特异性与肝癌细胞增殖、迁移、分化、凋亡和血管生成相关的靶基因结合，起到抑癌和抑制肝癌发展的作用；miRNA-122a也可以用预测肝硬化；miRNA-200a在组织和血清中均随着HCC的发展而降低，由此他们推测AFP与外泌体联合判断对HCC的预测能力强于单独使用AFP。此外Ahmed等[9]发现：miR-1246和miR-210可能是区分原发与继发性肝癌的指标：他们统计了33例原发性肝癌、22例继发性肝癌与30例正常组对照，原发组与继发组患者血清miR-210和miR-1246水平存在差异表达，miR-210与miR-1246在继发性肝癌中表达均显著高于原发性肝癌，具有统计学意义，同时他们利用ROC曲线分析miR-210在肝细胞癌与转移性恶性肿瘤鉴别中的敏感性和特异性分别为73.7%和64.28%，而miR-1246则分别为72.2%和67.8%。

二、药物诱导性肝损伤(DILI)

药物引起的肝损伤，一般是有两个途径，第一是药物本身的毒性引起的肝脏损害，第二，是药物诱导的自身免疫性的肝损害。目前临床诊断DILI主要依靠排除法，这种方法并不能很及时的诊断DILI，导致其误诊率及漏诊率增加。Conde-Vancells等[10]提取了DILI大鼠与正常大鼠尿液中的外泌体发现DILI大鼠表达CD26、CD81减少，血清中这种差异却不明显，这可能说明某些肝病的生物标记物只能根据特定体液中分离的外泌体进行转运。DILI时，在血浆中可检测到肝脏来源的微小RNA (miRNAs)和全长mRNAs，其中miR-122具有肝脏特异性，敏感性高，可用于对乙酰氨基酚所致DILI的早期诊断，且其半寿期短，可更好地反映肝损伤的消退。Cho等[11]研究发现循环血浆外泌体中的miR-122 与miR-192在对乙酰氨基酚诱导的肝损伤中升高, 并且用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸处理可恢复到基础水平，同样提示了miR-122与miR-192作为诊断DILI指标的可能性。Zheng等[12]发现在中药如川楝子引起的肝损伤中血清外泌体microRNA-370-3p下降明显，这些均提示了外泌体在DILI的潜在诊断意义。

三、酒精性肝炎(AH)与非酒精性脂肪肝病(NAFLD)

酒精性肝炎是长期过量饮酒所致的一种肝脏疾病；非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤，包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化。miR-122在肝细胞癌中的水平降低，而在酒精性肝病中升高，血清中miR-122 水平的升高可能与肝损害有关。血浆外泌体中miRNA-30a、miRNA-192 和CD40配体均有助于诊断酒精性肝炎。Verma等[13]发现乙醇通过激活半胱天冬酶3依赖的通路，刺激肝细胞分泌含有CD40配体的外泌体，促进巨噬细胞的活化，加重肝脏的炎症；另外一个研究[14]提示了血浆外泌体中miRNA-30a、miRNA-192有助于诊断酒精性肝炎，该研究发现miRNA -192和miRNA-30a 在长期饲饮乙醇的小鼠和慢性酒精性肝炎患者的血清中提取的EVs(细胞外囊泡)中表达均升高，在这些miRNAs中，miRNA192对酒精性肝炎的诊断准确性相对较高。Babuta等[15]发现ALD中，酒精诱导miR-155的增加，影响ALD自噬途径中的多个基因，降低溶酶体水平，抑制溶酶体相关膜蛋白1 (LAMP1)和溶酶体相关膜蛋白2 (LAMP2)，致使溶酶体功能失调，从而导致ALD，提示miR-155也可能作为酒精性肝炎的诊断标志物。

LEE等[16]发现晚期NAFLD患者较早期NAFLD患者血清中循环外泌体miR-192的水平升高，表明miR-192可能是NASH(非酒精性脂肪性肝炎)进展相关的潜在生物标志物。Ibrahim等[17]发现在非酒精性脂肪性肝炎患者中，肝细胞能释放含有趋化因子CXCL10的外泌体, 调节巨噬细胞的活化，加重肝脏的炎症；Kakazu等[18]研究发现脂质可能通过刺激肝细胞分泌含有神经酰胺的外泌体，通过S1P依赖的途径增加巨噬细胞的数量, 加重肝脏的炎症；提示血浆外泌体中CXCL10、神经酰胺和S1P均有可能成为诊断非酒精性脂肪性肝炎的指标。

四、病毒型肝炎

病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种传染病，常见的病毒性肝炎包括乙肝与丙肝。外泌体细胞间的通信作用可参与病毒感染期间的抗病毒及免疫调节过程。有学者从丙型肝炎病毒感染患者血清中分离出外泌体，含有丙型肝炎病毒核糖核酸、高浓度蛋白质和热休克蛋白90[19]，这些外泌体易于提取，具有一定的特异性，但目前尚未用于临床诊断病毒性肝炎。研究发现，不同类型的病毒，如人类免疫缺陷病毒，HBV和HCV通过外泌体将信号转导的蛋白质和功能miRNA转移到未感染的细胞中，研究中比较20例HBV患者与对照组血清外泌体，miR-18a、miR-221、miR-222，miR-224增加，而miR-101，miR-106b 、miR-122和miR-195 减少，miR-21没有显著区别，提示这些蛋白质可能参与HBV的发生发展，对其诊断有一定的指导意义。还有研究发现miR-155是一种与炎症相关的miRNA，在慢性HCV感染患者的血清和外周血单核细胞中表达水平升高，Welker等[20]发现慢性丙肝患者血清外泌体中CD81含量与炎症活动以及肝脏纤维化严重程度有关。Zhao等[21]通过比较来源于HBx(HBV中HBx基因)感染的Huh7细胞及对照组外泌体的蛋白成分，发现其中含肝癌相关蛋白(如VCP)，表明血清外泌体的某些特异蛋白可作为HBV或HBV导致的肝癌的标记物。

五、肝脏纤维化

肝脏纤维化是细胞坏死以及炎症刺激等引起肝脏细胞外基质沉积的病理过程，肝纤维化是一个病理生理过程，肝硬化是肝纤维化长期发展的晚期阶段。多项研究发现肝星状细胞(HSCs)与肝纤维化的形成密切相关，Chen等[22-23]研究发现miR-124和miR-199a-59经外泌体在HSCs间转运，减缓肝纤维化的发展进程，在肝脏发生纤维化时，外泌体携带的miR-214表达降低，推测miR-214可能是一种抑制肝纤维化的的标志物，此研究还提示了血清外泌体中CTGF有助于诊断肝纤维化。Wang等[24]发现内皮细胞来源的外泌体可调节肝星状细胞的活性；Momen等[25]发现来源于脂肪间充质干细胞的miR-122有减少HSCs的增值和分化的作用；外泌体中的miRNA-10b在肝硬化中表达增加，在肝癌阶段明显增加，可达正常水平的10倍以上。这些指标均有望在临床上成为观察肝纤维化早期以及进展阶段的指标。

六、妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)

ICP主要发生在妊娠晚期，以瘙痒和血清胆汁酸水平升高为特征。目前诊断ICP主要靠血清的胆汁酸水平。Jiang等[26]比较分析存在于ICP患者和健康孕妇尿液的外泌体，发现括miR-21、miR-29a和miR-590-3p在ICP患者和健康孕妇中有差异表达，它们的上调表达降低了细胞间黏附分子1 (ICAM1)的表达，进而增加了ICP的发生率，提示尿液中的miR-21、miR-29a和miR-590-3p可能成为ICP的新型筛选及诊断标志物。Zou等[27]发现ICP患者的miR-371a-5p、miR-6865-5p和miR-1182的表达水平显著高于正常孕妇组，也提供了外泌体miRNA可能成为ICP诊断标志物的证据。Zhang等[28]与Rao ZZ[29]等发现miR-148a与ICP的形成有潜在的联系。Ma等[30]发现hsa-miR-671-3p和hsa-miR-369-5p在ICP患者尿液中表达明显上调，提示母体尿miRNAs很有可能成为ICP诊断的非侵入性新型生物标志物。

综上所述，外泌体参与了多种肝病的发生发展过程，可能成为各种肝脏疾病发生进程、诊断、判断治疗效果及预后的指标。肝病是一个世界性的难题，微创肝活检是大多数肝病诊断的金标准，外泌体作为新的热点研究方向，可能成为新型、更可靠和非侵入性诊断标志物。